游泳训练次数对大鼠Morris水迷宫成绩的影响

胡志红， 闫君宝， 杨东伟(河南科技大学医学院生理学教研室，洛阳　471003)



游泳训练次数对大鼠Morris水迷宫成绩的影响

胡志红， 闫君宝， 杨东伟(河南科技大学医学院生理学教研室，洛阳471003)

摘要：目的探讨游泳训练次数对大鼠水迷宫成绩的影响。方法成年雄性SD大鼠36只，随机分为4次/d组(每天训练4次)和8次/d组(每天训练8次)，连续训练6 d，记录每次训练的潜伏期作为学习成绩，第7天通过Morris水迷宫空间探索实验检测大鼠的空间记忆能力。结果定位航行实验显示随着训练次数的增加，4次/d组和8次/d组大鼠的逃避潜伏期与第1天相比均明显缩短，而8次/d组大鼠每天的潜伏期均短于4次/d组，但差异无统计学意义(P>0.05)，空间探索实验结果显示两组大鼠无明显差异(P>0.05)。结论每天训练4次和每天训练8次，共训练6 d对大鼠空间学习记忆能力的影响无统计学差异，但每天训练8次组大鼠的学习能力提升速度快于每天训练4次组。

关键词：游泳训练；Morris水迷宫；学习记忆能力；大鼠

Morris水迷宫(Morris water maze，MWM)是英国心理学家Morris于20世纪80年代初设计并应用于大鼠学习记忆机制研究的[1]，经过不断改进及完善，目前已成为国内外评价动物空间学习记忆能力最常用的实验方法之一，广泛应用于神经药理学、神经生理学、老年病学等基础和应用研究中。实验动物通常经过一天数次连续数天的训练，可对水下站台产生空间定位记忆，但在具体的操作过程中，训练时程及每天具体的训练次数并没有统一的标准[2]。在既往研究中，每天训练次数为2-12次不等，训练时程为5-7 d[3-9]，每天训练的次数对空间学习、记忆的结果有何影响，目前尚没有报道。因此，本实验选取水迷宫实验中应用较多的每天训练4次及8次方法，连续训练6 d，探讨训练次数对大鼠空间学习记忆能力的影响，为MWM实验的进一步完善提供依据。

1材料与方法

1.1实验动物

健康SD雄性清洁级大鼠36只，体重190-230 g ，由河南科技大学动物中心提供。动物房室温控制在(22±2)℃，12 h光照/黑暗周期，动物自由饮水、摄食，大鼠在动物房适应一周后，随机分为每天训练4次组(4次/d组)和每天训练8次组(8次/d组)，每组18只。

1.2Morris水迷宫

Morris水迷宫实验系统由水迷宫装置、水迷宫图像自动采集和处理分析系统组成(成都泰盟科技有限公司研制)。圆形水迷宫水池直径150 cm，高50 cm，池壁以4个等距离点，即东(E)、南(S)、西(W)、北(N)将水池分为4个象限，分别在4个象限的中心沿池壁设置4个入水点。圆柱形平台放置于SW象限的中心位置，并没于水面下约2 cm。用脱脂奶粉将水搅浑，水温(21±1)℃。用遮光帘将水池围起，布帘上贴有不同形状、颜色的图形作为标记。大鼠头部染黑。训练时将大鼠分别从4个入水点头朝池壁轻轻放入，水池上方1.5 m处安放着连接显示系统的摄像机，通过处理分析系统分析可提供动物游泳的潜伏期(动物自入水到找到站台后四肢爬上站台时所需的时间)、游泳距离、游泳轨迹等参数。

1.3实验方法

定位航行实验(隐藏平台实验)，连续6 d。4次/d组：每天训练4次，随机分别从4个入水点入水。8次/d组的训练：每天训练8次，每天分2个时间段，中间间隔1 h，每个时间段训练4次，分别从4个入水点入水。在以上大鼠的训练中，每只大鼠每次游泳的时限为60 s，若大鼠在60 s内找到平台，则记录其从入水到爬上平台的时间(即潜伏期)。若大鼠在入水后60 s内未能找到站台，则由测试者引至站台，并在站台上停留15 s，潜伏期记为60 s。

空间探索试验，实验第7天，撤去隐藏平台，从目标象限对面入水点将大鼠面向池壁放于水中，记录60 s内大鼠跨越原平台位置的次数、平台所在象限的时间百分比、首次通过平台时间及游泳轨迹等参数。实验过程中应尽量保持实验环境的稳定性，包括测试者、大鼠行为测试时间等,尽量减少可引起大鼠行为改变的干扰因素。

1.4统计学分析

2结果

2.1空间学习能力比较

采用定位航行实验中的平均逃避潜伏期及游泳轨迹来评价两组大鼠的空间学习能力，结果显示：4次/d组和8次/d组大鼠在第1 天训练时的平均逃避潜伏期分别为(51.68±17.67)s和(48.29±12.55)s，差异无统计学意义(P>0.05)。随着训练次数的增加，两组大鼠的平均逃避潜伏期均明显缩短，4次/d组大鼠潜伏期在5 d后，8次/d组大鼠在3 d后均稳定在10 s左右，8次/d组大鼠的平均潜伏期在6 d的定位航行实验中短于4次/d组大鼠，但差异无统计学意义(P>0.05)。根据行为学分析软件计算两组大鼠的游泳速度，差异无统计学意义，说明两组大鼠的游泳能力无明显差异。两组大鼠第6天的游泳轨迹均为直线式(见图1)。提示随着训练次数的增加，两组大鼠的空间学习能力均明显增加。

组别第1天第2天第3天第4天第5天第6天4次/d组51.68±10.7632.72±11.5621.94±9.2316.56±8.7013.54±7.128.64±2.678次/d组48.29±12.5528.31±7.0216.19±8.5510.47±5.28.05±3.697.50±2.23P0.450.520.220.070.290.86

图1　大鼠在定位航行实验第6天的游泳轨迹Figure 1　The swimming path at day 6 in place navigation test

2.2空间记忆能力比较

采用空间探索实验中的跨越平台次数、目标象限时间百分比、首次到达平台的时间及游泳轨迹来评价两组大鼠的空间记忆能力。结果显示各项监测指标差异均无统计学意义(P>0.05,见表2)。两组大鼠在空间探索实验中的游泳轨迹显示，两组大鼠均有明显的目标象限偏好(见图2)。

组别游泳速度(cm/s)跨越平台次数目标象限时间百分比(%)首次通过平台时间(s)4次/d组21.48±4.122.59±0.3235.67±3.347.55±3.588次/d组20.57±3.602.83±0.2938.95±3.876.34±2.75P0.710.900.540.83

图2　大鼠空间探索实验游泳轨迹Figure 2　Swimming path in probe trial test

3讨论

Morris水迷宫实验是评价动物空间学习记忆能力的重要手段，实验装置[10]、训练时程[11]、实验时间[12]、游泳时间[13]、水温[14]等因素对水迷宫成绩的影响均已有报道，但水迷宫训练次数对其影响尚没有报道。在水迷宫实验中，动物可通过一定时程的多次训练而获得空间认知，训练次数对空间学习记忆能力的形成非常关键。但在此过程中每天训练次数、训练时程并没有统一的要求，文献报道有每天训练3次、5d共15次[3]，每天训练4次、6d共24次[4]，每天训练6次、6 d共36次[6]，每天训练8次、5d共40次[7]，及每天训练10次[8]、12次[9]等，应用较多的是每天训练4次或8次。因此，本实验采用每天训练4次或8次，共训练6 d，探讨训练次数对空间学习记忆的影响。

定位航行实验主要反映动物空间记忆的获得情况(即学习获取能力)。在排除运动障碍的情况下，逃避潜伏期是最为常用且相对稳定的参数[13]。在定位航行实验中大鼠通过多次训练寻找平台可以提高大鼠的空间学习能力，同时通过此学习过程建立了空间记忆。本实验两组大鼠的游泳速度无统计学差异，可排除运动能力的影响。定位航行实验结果显示：每天训练4次组大鼠和每天训练8次组大鼠随着训练次数的增加，逃避潜伏期均越来越短，而8次组的平均逃避潜伏期第1天至第6天均比4次组短，但无统计学差异，提示每天训练4次共24次和每天训练8次共48次均能明显提高大鼠空间学习能力。8次组大鼠在水迷宫训练3 d后，及4次组大鼠在训练5 d后，逃避潜伏期稳定在10 s左右，提示随着训练次数的增加至20-24次，空间学习能力可以达到饱和，呈现较稳定的状态，而且每天训练次数增加，会使实验动物学习能力提升较快，可以较快达到稳定状态。

空间探索实验测量的是动物的记忆保持能力。空间探索实验结果显示,每天训练4次组和每天训练8次组大鼠跨越平台的次数及首次通过平台的时间无明显差异，且均表现出明显的目标象限偏好，在目标象限停留的时间均明显高于其他象限，提示两组大鼠的空间记忆能力无明显差异，说明大鼠只要经过“足够”次数的训练，即可达到提取记忆的目的。但游泳训练次数对大鼠长期记忆的影响及作用机制还应进一步探讨。

空间学习与记忆是脑的高级神经生理活动之一，大脑皮层联络区、海马、纹状体、基底前脑、小脑等多个脑区参与其过程，组成一个功能完整的神经网络[15]。海马的完整性对于空间学习记忆至关重要[16]，但是海马牵涉其中的神经机制并不十分清楚。海马对于空间信息的获得、提取及对记忆的巩固和储存起着关键的作用[17]。文献报道，海马损伤大鼠需要增加训练次数才可以达到相对稳定的状态，而正常大鼠经过短期的训练足以达到稳定的学习状态。

参考文献：

[1]Morris R.Developments of a water maze procedure for studying spatial learning in the rat[J].J Neurosci Methods,1984,11(1):47-60.

[2]Vorhees CV,Williams MT.Morris water maze:procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory[J].Nat Protoc,2006,1(2):848-858.

[3]Han T,Hu Z,Tang Y,etal.Inhibiting Rho kinase 2 reduces memory dysfunction in adult rats exposed to sevoflurane at postnatal days 7-9[J].Biomed Rep,2015,3(3):361-364.

[4]Wang X,Wang LP,Tang H,etal.Acetyl-L-carnitine rescues scopolamine-induced memory deficits by restoring insulin-like growth factor II via decreasing p53 oxidation[J].Neuropharmacology,2014,76 PtA:80-87.

[5]Burwell RD,Saddoris MP,Bucci DJ,etal.Cortico hippocampal contributions to spatial and contextual learning[J].J Neurosci,2004,24(15):3826-3836.

[6]Limback-Stokin K,Korzus E,Nagaoka-Yasuda R,etal.Nuclear calcium/calmodultin regulates memory consolidation[J].J Neurosci,2004,24(48):10858-10867.

[7]樊云峰.运志提取物对阿尔采末病模型大鼠学习记忆能力的影响[J].中国新药与临床杂志，2015，34(7)：517-521.

[8]于玮，谢雯，罗禹，等.不同训练方式建立大鼠空间记忆后海马结构中BDNF表达的变化[J].华中科技大学学报(医学版)，2015，44(1)：16-22.

[9]Guzowski JF,Setlow B,Wagner EK,etal.Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning:a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos,and zif268[J]. J Neurosci, 2001, 21(14):5089-5098.

[10]张玉霞，李玥，宋涛.不同平台对大鼠Morris水迷宫学习记忆能力的影响[J].山东大学学报(医学版)，2014，52(7)：7-9.

[11]边慧，方松，谬应达，等.两种不同训练时程方法对海马损伤大鼠水迷宫成绩的影响[J].动物学研究，2012，33(2)：237-240.

[12]邓世宁，司文，孙丽娟，等.实验时间对老年Sprague-Dawley大鼠认知行为的影响[J].生理学报，2010，62(3)：231-236.

[13]胡镜清，温泽淮，赖世隆.Morris水迷宫检测的记忆属性与方法学初探[J].广州中医药大学学报，2000，17(2)：117-119.

[14]Iivonen H,Liisa N,Harri M,etal.Hypothermia in mice tested in Morris water maze[J].Behav Brain Res,2003,141(2):207-213.

[15]方松，余化霖.Morris水迷宫实验中海马相关空间学习记忆的研究进展[J].国际病理科学与临床杂志，2010，30(4)：321-326.

[16]Oliveira AA,Nogueira CR,Nascimento VS,etal.Evaluation of levetiracetam effects on pilocarpine-induced seizures:cholinergic muscarinic system involvement[J].Neurosci Lett,2005,385(3):184-188.

[17]de Vasconcellos AP,Zugno AI,Dos Santos AH,etal.Na+,K+-ATPase Activity is reduced in hippocampus of rats submitted to an experimental model of depression:Effect of chronic lithium treatment andpossible involvement in learning deficits[J].Neurobiol Learn Mem,2005,84(2):102-110.

Effect of swimming numbers on the learning and memory performance of rats in Morris water maze

HU Zhihong, YAN Junbao, YANG Dongwei

(DepartmentofPhysiology,MedicalCollege,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the effect of daily trial numbers on spatial learning and memory performance by Morris water maze.MethodsThirty-six male adult SD rats were randomly divided into two groups: 4 times/d group and 8 times/d group. The rats were given 4 trials per day in 4 times/d group and 8 trials per day in 8 times/d group for 6 d. The abilities of spatial learning and memory of the rats were evaluated at 7 d by Morris water maze. ResultsThe navigation test showed that the escape latencies in the two groups decreased along with the increase of trial numbers. The latencies were shorter in 8 times/d group than that in 4 times/d group from day 1 to day 6 in Morris water maze, but there was no significant difference between two groups(P>0.05). There was no significant difference in probe trial test between two groups(P>0.05).ConclusionThe 4 trials and 8 trials per day for 6 d may not affect the spatial learning and memory capability in Morris water maze, but the improvement of learning performance in 8 times/d group is faster than that in 4 times/d group.

Key words:swimming trainning;Morris water maze;learning and memory abilities;rats

[收稿日期：2015-10-26]

作者简介：胡志红，女，1967-09生，硕士，副教授，E-mail:yxyhzh@haust.edu.cn.

中图分类号：Q42；R338

文献标志码：A

文章编号：1007-6611(2016)01-0018-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.005

基金项目：河南省教育厅科学技术研究重点资助项目(13A310250)