中耳炎影响内耳的分子机理探索

王亚娜,张　良

(天津市公安医院 耳鼻喉科,天津300042)



中耳炎影响内耳的分子机理探索

王亚娜,张良*

(天津市公安医院 耳鼻喉科,天津300042)

中耳炎是儿童仅次于上呼吸道感染的第二大常见疾病,病理特点包括中耳(例如咽鼓管、鼓窦、鼓室及乳突气房)全部或部分结构的炎性病变,发病原因主要是细菌及病毒感染[1]。急性中耳炎是中耳黏膜的急性化脓性炎症,通常持续数天[2]。慢性中耳炎会将病变炎症部位延伸至内耳[3]。持续的内耳损伤可以导致感觉神经性听力丧失、阻碍语言能力的发展及社交障碍[4,5]。有效的控制内耳炎症的后遗症是保护青少年听力的重要环节,然而导致内耳炎症的发病机制仍不清楚。

利用分子生物学手段研究中耳炎是当前该领域研究的发展趋势；而通过基因芯片或测序技术和生物信息学分析,在转录水平对基因的表达调控网络及机制进行全面而系统的分析,是筛选疾病相关基因最有效的途径。本研究采用表达谱基因芯片技术,6个正常小鼠内耳组织和8个中耳炎小鼠内耳组织进行分析,探讨差异表达基因之间的相互作用关系,并预测可能调控这些基因表达的miRNA,在整体转录水平上分析中耳炎的发病机理。

1材料与方法

1.1基因表达谱数据

本次研究的基因表达谱数据GSE49122[6]取自NCBI的GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),疾病组织类型为中耳炎内耳组织,包括6个正常小鼠内耳组织和8个中耳炎小鼠内耳组织。提取出组织中的RNA之后,基于GPL1261 Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array平台探测它们在组织中的表达值。

1.2芯片数据处理及数据分析

下载得到原始CEL格式数据后,导入R编程语言,基于affy[7]函数包进行背景校准、去除组间差异标准化,得到可以进行后续分析的基因表达值矩阵格式数据。随后,利用limma[8]函数包,对基因在中耳炎和正常小鼠内耳组织中的表达值进行student’st检验,并利用Benjamini&Hochberg(BH)校正方法对得到的P值进行校正,把满足表达值变化倍数大于2或者小于0.5并且校正P值小于0.05的基因作为中耳炎小鼠内耳组织相对于正常小鼠内耳组织的差异表达基因(DEGs)。

1.3功能与通路富集分析

在得到DEGs之后,利用DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)[9]在线工具对它们进行功能和通路富集分析。以P值小于0.05为阈值,筛选DEGs富集的基因本体条目(GO terms)和通路(KEGG pathways)。

1.4miRNA-Gene调控网络构建

miRNA是一种长度大约在22-25nt的非编码RNA,它可以在翻译过程中通过抑制基因翻译或者降解蛋白来抑制基因的表达。TargetScan(http://www.targetscan.org/)[10]是一个收录了包括人类和小鼠在内的多个物种的miRNA与基因之间调控关系的数据库,本次研究通过TargetScan数据库,得到了可能调控DEGs的miRNA,并且利用Cytoscape[11]软件构建了miRNA-Gene调控网络。

1.5基因相互作用网络构建

在生物体的大部分生物过程中,基因都通过与其他基因的相互作用来发挥作用,而不是单独发挥作用。STRING(http://string-db.org/)[12]数据库通过整理已有的诸如高通量数据、实验室低通量数据等信息来源,形成了许多物种的基因之间的相互作用,并以一个综合得分来评估一对相互作用的可靠性。本次研究通过STRING数据库,以综合得分大于0.4为阈值,筛选出基因之间的相互作用对,并通过Cytoscape软件构建出基因相互作用网络(PPI)。

2结果

2.1芯片数据分析结果

预处理之后,芯片上的基因在各个样本中的表达值见图1A,由A可以得到标准化后芯片上所有基因的整体表达值在各样本之间基本上是一致的,这说明预处理消除了组间差异,使后续的差异分析更加可靠。与正常小鼠内耳组织相比,在中耳炎小鼠内耳组织中得到了195个DEGs(图1B),并且由图1C可知DEGs能够很好的将正常和中耳炎小鼠分开,这也证明了得到的DEGs的可靠性。其中,前10个下调和上调倍数最多的基因见表1。

图1芯片数据的预处理及差异表达基因筛选A：标准化后芯片上所有基因在每个样本中的表达值,蓝色样本是正常小鼠样本,绿色样本是中耳炎小鼠样本,纵轴是表达值。B：差异表达基因分布,黑点是非差异表达基因,红点是在中耳炎小鼠中表达上调的基因,共有176个,蓝点是在中耳炎小鼠中表达下调的基因,共有19个。C：差异表达基因及样本的双向聚类。

表1在中耳炎样本中下调和上调倍数最大的前10个基因

下调基因基因符号log2(FC)P值上调基因基因符号log2(FC)P值Cyp4a12a-2.001.03×10-7Cxcl27.501.18×10-19Gkn3-1.763.06×10-8Cxcl37.411.64×10-18Cyp2f2-1.481.83×10-7Il67.341.24×10-18Fat3-1.333.09×10-7Ccl207.112.37×10-17Rsph4a-1.308.64×10-7Cxcl16.701.10×10-18Upk3b-1.216.06×10-7Csf36.613.31×10-17Cyp2b10-1.164.53×10-6Saa35.961.18×10-91700007K13Rik-1.121.06×10-4Saa15.722.37×10-15Gm626-1.121.17×10-3Irg15.701.10×10-14Wdr78-1.107.56×10-6Cxcl104.809.61×10-19

注：log2(FC)中FC是指变化倍数。

2.2富集的功能和通路

把DEGs上传到DAVID数据库中,发现这些基因主要富集于与炎症或者免疫等生物过程相关的GO terms及KEGG pathways。其中,按照P值最显著的前20个GO terms见图2,得到的13条富集的通路见表2。

2.3在TargetScan数据库中,得到了可能调控DEGs的miRNA共115个,它们与DEGs形成了319个miRNA-Gene调控关系对。其中,miRNA-Gene调控网络见图3A。在miRNA-Gene网络中,基因所受到的miRNA的直接调控个数称为该基因的节点度。

图2　差异表达基因富集的GO terms

通路名称基因数目P值细胞因子-细胞因子受体相互作用333.49×10-26趋化因子信号通路192.51×10-12NOD样受体信号通路121.23×10-10Toll样受体信号通路131.65×10-9胞浆DNA的感应通路74.80×10-5造血细胞系86.37×10-5JAK-STAT信号通路108.29×10-5移植物抗宿主病66.49×10-4MAPK信号通路111.27×10-3细胞凋亡64.00×10-3Ⅰ型糖尿病57.04×10-3朊病毒疾病48.61×10-3移植排斥反应43.33×10-2

2.4PPI网络

在STRING数据库中,以综合得分大于0.4为阈值,共得到了828个基因之间的相互作用对。其中,PPI网络见图3B。与miRNA-Gene网络类似,在PPI网络中与某基因有直接相互作用的基因的个数称为该基因的节点度。并且我们发现,有10个基因在PPI网络和miRNA-Gene调控网络中的节点度都大于等于5(表3),并且这些基因在中耳炎小鼠内耳组织表达值相对于正常小鼠内耳组织表达值都发生了较大的变化(图4),所以这些基因可能在中耳炎对内耳产生影响中有较重要的作用。

图3差异表达基因的miRNA-Gene调控网络和PPI网络。A：miRNA-Gene调控网络,浅蓝色六边形是差异表达基因,绿色三角形是miRNA。B：PPI网络,深蓝色长方形是在中耳炎小鼠中表达下调的基因,红色长方形是在中耳炎小鼠中表达上调的基因

表3在miRNA-Gene和PPI网络中节点度都大于等于5的基因

基因符号miRNA-Gene网络节点度PPI网络节点度Lif176Hbegf147Has295Fos934Osmr68Csrnp165Ptx357Ptgs2534Il10524Fosl1518

3讨论

中耳炎是临床上最常见的儿童感染类疾病之一,尽管多数病例可以得到满意的治疗效果,但接近20%的儿童患者会复发,或转变成慢性中耳炎,并最终导致多种并发症的发生,包括传导性耳聋和感音神经性耳聋,严重影响儿童语言能力的发展。所以更深刻的了解中耳炎发病过程中的炎症病理机制,有助于阻止中耳炎及其并发症的发生。

图4　　　　在PPI和miRNA-Gene网络中节点度都大于等于5的

在本研究中,我们通过分析基因表达谱芯片,对6个正常小鼠内耳组织和8个中耳炎小鼠内耳组织中基因的表达进行高通量分析,获得195个差异表达基因,其中表达上调的有176个,表达下调的有19个。

GO分析是指对所有差异表达基因进行相应的GO功能注释,随后对所有GO进行显著性分析,进而达到对基因的表达及其功能进行系统而全面分析的目的。本研究对195个差异表达基因进行GO分析,结果发现差异表达基因主要富集于白细胞趋化、细胞因子产生调节、炎症反应和免疫反应等GO条目,而且这些生理变化可能和中耳炎的发病机理密切相关。KEGG(京都基因与基因组百科全书)是基因组破译方面的数据库,KEGG 的PATHWAY 数据库整合当前在信号通路和分子互动网络信息。本研究对195个差异表达基因进行KEGG PATHWAY分析,结果发现差异表达基因主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路和MAPK信号通路等信号通路。这些信号通路与免疫系统的激活密切相关,提示这些基因和信号通路可能在中耳炎的发病过程中发挥重要的作用。

Hbegf (Heparin-Binding EGF-Like Growth Factor)是一个蛋白编码基因,参与PI-3K信号通路、生长因子活性和上皮生长因子受体的绑定,其表达水平与围产期坏死性小肠结肠炎和白喉密切相关。Suzukawa等[13]报道,在小鼠中耳炎模型中,HB-EGF促进中耳黏膜上皮的增生,并提示HB-EGF可能是改善黏膜生长的治疗靶点,进而阻止这种儿童疾病后遗症的发生。在我们的研究中,发现Hbegf在中耳炎小鼠内耳组织中的表达同样显著升高。我们对该基因进一步进行miRNA-Gene网络节点度和PPI网络节点度分析,发现该基因的表达受到miR-203、miR-182和miR-194等14个miRNA的调控,而且该基因可能与Mmp3、Ptgs2和I16等7个差异表达基因相互作用,提示该基因在中耳炎的发生发展过程中起至关重要的作用。

总而言之,我们的结果结合其他小组的研究可能为中耳炎的发病基因及其后遗症的理解提供了宝贵的理论支持。然而,有些结果还是有争议的；所以,我们需要更大的样本量和分子生物学实验来进一步解释相关miRNA和基因是如何参与中耳炎致病基因的表达。

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(收稿日期：2015-09-26)

*通讯作者

文章编号：1007-4287(2016)04-0540-04