黄芩素对人结肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及机制

王宁，程琦，张延新(漯河医学高等专科学校，河南漯河462002)



黄芩素对人结肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及机制

王宁，程琦，张延新(漯河医学高等专科学校，河南漯河462002)

摘要：目的探讨黄芩素对人结肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及其作用机制。方法 取处于对数生长期的人结肠癌SW480细胞，随机分为对照组,25、50、100 μmol/L黄芩素处理组，分别加入生理盐水,25、50、100 μmol/L黄芩素处理，采用EdU、MTT、流式细胞术及Transwell小室实验观察黄芩素对结肠癌细胞增殖、凋亡及侵袭的影响，并通过Western blotting法检测黄芩素干预后结肠癌细胞Bcl-2、Bax及VEGF蛋白表达。结果25、50、100 μmol/L黄芩素处理组SW480细胞增殖受到抑制，呈剂量、时间依赖性；25、50、100 μmol/L黄芩素处理组SW480细胞凋亡率依次升高；25、50、100 μmol/L黄芩素处理组SW480细胞的侵袭迁移能力降低；黄芩素干预后SW480细胞中Bcl-2、VEGF蛋白表达下调，Bax蛋白表达上调(P<0.05)。结论 黄芩素抑制人结肠癌细胞的增殖及侵袭，并促进其凋亡，机制可能与下调Bcl-2、VEGF蛋白表达并上调Bax蛋白表达有关。

关键词：结肠肿瘤；黄芩素；细胞增殖；细胞凋亡；血管内皮生长因子

结肠癌已成为世界范围内诸多国家恶性肿瘤高病死率的原因之一[1]，在发达国家每年影响人数超过一百万人[2]。我国恶性肿瘤患者中，结肠癌的发病率和病死率均较高[3]。黄芩别名山茶根、土金茶根，归于唇形科黄芩属，为多年生草本植物，常以干燥根入药。现代药理研究发现其具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌及抗炎活性[4～6]。黄芩素是黄芩根中的主要黄酮类化学成分，有研究表明黄芩素能抑制人卵巢癌、胶质瘤和骨髓瘤细胞生长及诱导其细胞凋亡的作用[7,8]。然而有关黄芩素在人结肠癌细胞中的生物学功能研究较少。2014年9月～2015年5月，我们观察黄芩素对人结肠癌细胞系SW480细胞增殖、凋亡、侵袭的影响，探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1材料人结肠癌细胞系SW480购于上海生物研究所，来源为人结肠低分化黏液腺癌。黄芩素、MTT 购自Sigma公司；EdU检测试剂盒购自Invitrogen公司； Annexin V-FITC 试剂盒及蛋白提取试剂盒购自Calbiochem公司；DMEM培养基及胎牛血清购自Gibco公司；Transwell小室购自美国BD公司；兔抗人单克隆Bax、Bcl-2及VEGF抗体购自ABCam公司；山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥公司。

1.2细胞培养将SW480细胞常规培养于含10%小牛血清的DMEM培养基，并置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中进行培养。

1.3细胞增殖情况观察收集对数期生长期的SW480细胞，调整浓度为5×104/mL的细胞悬液，以100 μL/孔接种于96孔板，5%CO2、37 ℃培养24 h。分别加入相应的黄芩素溶液并使其终浓度分别为25、50、100 μmol/L，设立空白对照，继续培养24、48 h，每孔加入100 μL含有浓度为50 μmol/L的EdU培养基孵育2 h，然后加入100 μL的固定液进行固定。按照EdU检测试剂盒的说明书进行EdU染色。随后用Hoechst 33342进行细胞核复染。荧光显微镜下观察并记录。收集对数生长期的SW480细胞，调整为浓度为5×104/mL的细胞悬液，以100 μL/孔接种于96孔板，5% CO2、37 ℃培养24 h。分别加入相应的黄芩素溶液并使其最终浓度分别为25、50、100 μmol/L，设立空白对照。继续培养12、24、36、48 h后，每孔加浓度为5 mg/mL的 MTT溶液 10 μL，孵育4 h后终止，振荡15 min，选择490 nm波长，于酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度OD值，绘制生长曲线。

1.4细胞凋亡率测算收集对数生长期的SW480细胞，调整浓度为5×104/mL的细胞悬液，按照每孔2 mL接种于6孔板中，待细胞贴壁后，分别加入相应的黄芩素溶液并使其最终浓度分别为25、50、100 μmol/L，设立空白对照，继续培养48 h。按照说明书操作，流式细胞术检测细胞凋亡情况。

1.5细胞侵袭迁移能力检测进行Transwell迁移实验。将Matrigel稀释浓度为10 μg/μL后，包被Transwell小室，分隔成上下小室。将不同浓度黄芩素处理48 h后的SW480细胞调整浓度为1×105/mL，取200 μL加入上室，下室加入600 μL的完全培养基，5%CO2、37 ℃环境下培养10 h。取出Transwell小室，并用PBS湿润，然后用棉球擦去上室表面黏附的细胞，PBS洗涤2次。将Transwell小室用4%甲醛溶液固定15 min，乙醇脱水，结晶紫染色，显微镜下观察并计数上室迁移至微孔膜下层的细胞。

1.6血清Bcl-2、Bax及VEGF蛋白表达检测采用免疫印迹Western blotting法检测。将浓度为5×104/mL的SW480细胞悬液以2 mL/孔接种于6孔培养板中，终浓度分别为25、50、100 μmol/L的黄芩素处理48 h后，弃上清，按蛋白提取试剂盒说明进行蛋白提取，并测定其浓度。50 μg/孔总蛋白上样，10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜，封闭，洗涤，Bcl-2、Bax、VEGF、β-actin一抗孵育(1∶1 000)，4 ℃过夜，TBS洗涤3次，加入二抗(1∶5 000)孵育，洗涤，ECL显色液显色检测蛋白的表达。

2结果

2.1黄芩素干预后结肠癌细胞增殖情况黄芩素处理24 h后，对照组、25、50、100 μmol/L每10×视野下黄芩素处理组处于S期的结肠癌细胞和该视野下全部细胞数比值分别为47/89、45/95、42/90、37/82，与对照组相比，100 μmol/L黄芩素处理组处于S期的细胞比例显著降低(P<0.05)；经黄芩素处理48 h后，对照组、25、50、100 μmol/L黄芩素处理组每10×视野下黄芩素处理组处于S期的结肠癌细胞和该视野下全部细胞数比值分别为63/134、42/97、37/91、28/81，与对照组相比，100 μmol/L黄芩素处理组处于S期的细胞比例显著降低(P<0.01)。黄芩素对SW480细胞生长有抑制作用，并呈剂量、时间依赖性。见图1。

图1　不同处理组SW480肿瘤细胞的生长曲线

2.2黄芩素干预后结肠癌细胞凋亡率对照组，25、50、100 μmol/L黄芩素处理组的细胞凋亡率分别为(6.71±0.85)%、(7.59±0.94)%、(8.57±0.64)%、(14.14±1.34)%。与对照组相比，50 μmol/L黄芩素处理组细胞凋亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05)，100 μmol/L黄芩素处理组的凋亡率明显高于其他组(P均<0.01)。

2.3黄芩素干预后结肠癌细胞的侵袭迁移能力对照组，25、50、100 μmol/L黄芩素处理组侵袭到下层的细胞数分别为(112±11)%、(99±8)%、(90±12)%、(68±14)%。与对照组相比，25、50、100 μmol/L黄芩素处理组细胞迁移数量分别下降11.61%(P=0.105)、19.64%(P=0.035)、39.29%(P=0.003)。

2.4黄芩素对凋亡相关基因Bcl-2、Bax及VEGF表达的影响对照组，25、50、100 μmol/L黄芩素处理组中，Bcl-2的表达量分别为59.87±5.15、58.19±8.34、47.58±4.76、32.20±6.28；Bax表达量分别为19.68±5.76、31.57±5.83、34.23±6.75、42.47±7.02；VEGF的表达量分别为39.97±4.85、31.79±9.23、31.13±5.19、17.90±4.33。与对照组相比，50、100 μmol/L黄芩素处理组Bcl-2蛋白表达显著低于对照组，Bax高于对照组(P<0.05)；100 μmol/L黄芩素处理组VEGF蛋白表达低于对照组(P<0.05)。

3讨论

已有研究表明黄芩素可通过不同途径抑制肿瘤细胞的增殖并诱导凋亡。黄芩素能抑制肝癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡[9]；黄芩素及其硫酸化衍生物能通过依赖ROS途径诱导人乳腺癌细胞MCF-7发生凋亡[10]；黄芩素被广泛用于血液系统的抗肿瘤研究，有一定抗血液系统肿瘤活性[11]；其亦能通过抑制胃癌细胞VEGF和HGF表达来抑制胃癌细胞的增殖与凋亡[12];此外黄芩素能抑制人胰腺癌 PANC-1细胞增殖，影响肿瘤细胞的伪足形成，导致细胞的侵袭力下降[13]。本研究结果表明黄芩素可通过抑制人结肠癌SW480细胞的DNA合成来抑制其增殖，并呈剂量、时间依赖性。流式细胞仪检测结果表明黄芩素能促进SW480细胞凋亡。Transwell小室实验提示黄芩素还能抑制SW480细胞的侵袭迁移能力。

Caspase蛋白家族和Bcl-2蛋白家族是参与凋亡进程的两个蛋白家族，前者负责凋亡的执行，后者调控线粒体的完整性[14]。Bcl-2保护细胞线粒体的完整性，抑制细胞色素C的释放，而Bax在线粒体膜上形成多聚体影响其完整性，使线粒体释放Caspase活化因子，诱导Caspase引起的细胞凋亡。Bcl-2蛋白家族所介导的细胞凋亡通路，不单是通过改变某个蛋白的表达水平来调控，而是通过改变促凋亡和抗凋亡蛋白的比例来实现。本研究结果显示黄芩素可明显增加Bax的表达，并抑制Bcl-2蛋白的表达，从而降低了Bcl-2/Bax 蛋白表达水平的比例，提示黄芩素促进SW480细胞凋亡可能与以线粒体为核心的凋亡途径有关。

VEGF能通过与VEGF受体结合，刺激血管内皮细胞增殖、迁移并形成新生血管，与肿瘤细胞的侵袭迁移能力密切相关[15]。本研究中SW480经黄芩素处理48 h后，与对照组比较，VEGF蛋白表达减少，细胞增殖能力下降，凋亡细胞增多，细胞侵袭迁移能力下降，提示黄芩素可能通过抑制VEGF表达，降低SW480细胞的侵袭迁移能力，进一步影响肿瘤细胞的增殖和凋亡。

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Effects of baicalein on proliferation, apoptosis and invasion of human colorectal cancer cells

WANGNing,CHENGQi,ZHANGYanxin

(LuoheMedicalCollege,Luohe462002,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of baicalein on proliferation, apoptosis and invasion of human colorectal cancer cells and to explore the mechanism. MethodsHuman colorectal cancer cells SW480 in logarithmic phase were randomly divided into the control group, 25, 50 and 100 μmol/L baicalein treatment groups which were respectively treated with normal saline, 25, 50 and 100 μmol/L baicalein. The effects of baicalein on proliferation, apoptosis and invasion of SW480 cells were detected by EdU, MTT, flow cytometry and Transwell test. The protein expression of Bcl-2, Bax and vascular endothelial growth factor (VEGF) in SW480 cells after the treatment of baicalein was detected by Western blotting.ResultsIn the 25, 50 and 100 μmol/L baicalein treatment groups, the proliferation of SW480 cells was inhibited with a dose and time-dependent manner, the apoptosis rates of SW480 cells were gradually increased, and the invasion abilities of SW480 cells were gradually decreased. After the treatment of baicalein, the expression of Bcl-2 and VEGF in SW480 cells was down-regulated, and the expression of Bax was up-regulated (P<0.05). ConclusionBaicalein inhibits the proliferation and invasion of SW480 cells and promots the apoptosis, which might be related with the down-regulation of Bcl-2 and VEGF expression and the up-regulation of Bax expression.

Key words:colorectal neoplasms; baicalein; cell proliferation; apoptosis; vascular endothelial growth factor

(收稿日期：2015-09-20)

中图分类号：R735.35

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)13-0010-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.004

第一作者简介：王宁(1983-)，男，硕士，讲师，主要研究方向为肿瘤病理与肿瘤细胞生物学。E-mail:wntot@126.com

基金项目：河南省教育厅青年教师资助项目(2012GGJS-269)；漯河医学高等专科学校科学研究项目(2010S06)。