结直肠癌围手术期患者外周血T淋巴细胞CD69、HLA-DR表达变化及意义

王祥安，吴琼，虞黎明，邹镇洪，蔡磊，熊妮，杨刚(南昌大学第二附属医院，南昌330006；南昌大学)



结直肠癌围手术期患者外周血T淋巴细胞CD69、HLA-DR表达变化及意义

王祥安1，吴琼1，虞黎明1，邹镇洪1，蔡磊1，熊妮2，杨刚1(1南昌大学第二附属医院，南昌330006；2南昌大学)

摘要：目的观察结直肠癌患者围手术期外周血T淋巴细胞CD69、HLA-DR的表达变化，并探讨其临床意义。方法 采用流式细胞仪检测40例结直肠癌患者(观察组)术前、术后第5、10天外周血T淋巴细胞CD69、HLA-DR的表达，并与同期检测15例健康体检者(对照组)进行比较，分析CD69、HLA-DR表达与临床病理参数的关系。结果观察组术前CD69、HLA-DR表达明显低于对照组(P<0.05)，术后CD69、HLA-DR表达水平均较术前明显提高(P<0.05)。HLA-DR表达与淋巴结转移、远处转移、TNM分期有关(P<0.05),与其余临床病理参数无关(P均﹥0.05)。 结论 结直肠癌患者术前外周血T淋巴细胞CD69、HLA-DR表达明显降低，术后逐渐升高；检测二者表达有助于病情判断，进一步指导结直肠癌免疫治疗。

关键词：结直肠肿瘤;围手术期;T淋巴细胞;CD69;HLA-DR

我国结直肠癌发病率不断上升，据统计现已跃居恶性肿瘤第二位[1]。结直肠癌早期筛查率与诊断率低，多数患者发现时已处于进展期。T淋巴细胞参与任何免疫反应均必须首先被活化[2]，CD69、HLA-DR为T淋巴细胞活化分子标志物。2015年3～7月，我们对40例结直肠癌患者外周血T淋巴细胞CD69、HLA-DR表达进行检测，探讨其临床意义。

1资料与方法

1.1临床资料结直肠癌患者40例(观察组)，男21例、女19例，年龄(58.0±11.1)岁。纳入标准：①术前内镜活检病理确诊为结直肠癌；②术前未接受放、化疗及其他抗肿瘤治疗措施。排除标准：①病程合并自身免疫疾病或接受过骨髓移植；②使用免疫抑制剂；③合并其他恶性肿瘤及肿瘤手术史；④急、慢性感染者。肿瘤位于结肠17例，直肠23例；肿瘤长径<3 cm 10例，≥3 cm 30例；肿瘤侵犯程度T1～T2期17例，T3～T4期23例；淋巴结转移14例，远处转移37例，TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期22例，Ⅲ～Ⅳ期18例。对照组为15例健康体检者，男8例、女7例，年龄(57.7±10.1)岁。两组年龄、性别比较差异无统计学意义(P均>0.05)。本研究均取得患者知情同意和医院伦理委员会批准。

1.2外周血T淋巴细胞CD69、HLA-DR表达检测采集观察组术前、术后第5、10天和健康体检者1次空腹外周静脉血4 mL，肝素抗凝后备用(24 h内)。取3个流式试管编号，分别向试管中加入anti-CD3/CD4/IgG1、CD69、HLA-DR各5 μL，均加入50 μL抗凝全血，振荡混匀，室温避光孵育15 min后,加10%溶血素1 mL，振荡混匀，室温避光孵育12 min后离心(1 250 r/min)5 min，弃上清液，加入300 μL PBS，振荡混匀后上流式细胞仪检测(2 h内)CD69、HLA-DR的表达，以百分数表示，Cell Quest软件获取和分析数据。

2结果

2.1两组手术前后外周血T淋巴细胞中CD69、HLA-DR表达比较观察组CD69、HLA-DR表达水平明显低于对照组(P<0.05)，术后第5、10天CD69、HLA-DR表达水平较术前明显升高(P均<0.05)。见表1。

表1　　　　两组外周血T淋巴细胞中CD69、HLA-DR

注：与同组术前比较，*P<0.05；与对照组比较，○P<0.05。

2.2观察组CD69、HLA-DR表达水平与临床病理参数的关系围手术期CD69、HLA-DR表达水平与性别、年龄、肿瘤生长部位、肿瘤侵犯程度无关(P﹥0.05)。肿瘤长径<3 cm者术前HLA-DR表达水平明显低于长径≥3 cm者(P<0.05)；其余指标比较无统计学差异(P﹥0.05)。CD69表达不受有无远处转移影响(P﹥0.05)；术后有远处转移者HLA-DR表达明显高于无远处转移者(P<0.05)。有淋巴结转移和不同TNM分期主要影响术前CD69和整个围手术期HLA-DR表达，无淋巴结转移和Ⅰ～Ⅱ期CD69表达水平明显高于有淋巴结转移和Ⅲ～Ⅳ期(P﹥0.05)，而HLA-DR表达明显低于有淋巴结转移和Ⅲ～Ⅳ期。见表2。

3讨论

医学研究认为肿瘤的发生、转移与免疫逃逸有关，活化后的T细胞发挥重要的免疫监视作用[3]。CD69是T淋巴细胞活化后表达最早的一种膜表面分子，活化后可进一步刺激T细胞增殖与活化，诱导Th1样细胞因子的分泌,可间接杀伤肿瘤[4]，同时诱导HLA-DR表达。HLA-DR是主要组织相容抗原复合物MHC-Ⅱ类分子，被诱导/辅助T淋巴细胞识别，其不表达与低表达造成无法提呈肿瘤抗原，进一步无法诱导细胞毒性T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞等。

本研究观察组术前外周血T淋巴细胞CD69、HLA-DR活化表达明显低于对照组, 说明T细胞活化不足，难以执行肿瘤免疫监视作用，导致术前处于肿瘤免疫抑制状态，更利于肿瘤生长浸润和转移。术后第5、10天CD69、HLA-DR表达水平均较术前明显升高，说明机体在去瘤后可解除肿瘤源性的免疫抑制状态。观察组术前CD69表达水平在Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴结转移中更低，术后均逐渐升高，但仍未达到对照组水平。这可能是受手术及麻醉等因素影响造成术后免疫功能仍处于受损状态，去瘤后诱导刺激T细胞活化的过程并非能立即恢复正常。HLA-DR在组织细胞中一般不表达或低表达，当肿瘤发生时，肿瘤细胞可分泌部分免疫抑制性细胞因子，如IL-10、TGF-β等，减弱肿瘤的排斥效应[5]，肿瘤细胞高表达FasL可通过FasL-Fas途径介导肿瘤特异性T细胞凋亡[6]及肿瘤弱免疫原性抗原等免疫逃逸机制导致其免疫抑制，进而导致外周血HLA-DR水平低于正常人。但同时肿瘤细胞表面MHC分子开始表达，肿瘤抗原激活T细胞免疫，提高免疫监视及诱导相关细胞毒性对抗肿瘤，有研究证实荷瘤机体免疫尽管受到抑制，活化的T辅助细胞CD4介导的细胞毒效应仍不断进行[7]。本研究结果显示观察组分期较晚、肿瘤长径较大、淋巴结转移及远处转移时HLA-DR表达水平较高，但仍低于对照组。肿瘤免疫结构能更好地预测患者预后[8～10],且手术去瘤、化疗、放疗和免疫治疗均能触发特异性抗肿瘤反应，改变肿瘤微环境，逆转免疫抑制[11,12]。

表2　结直肠癌患者CD69、HLA-DR表达与临床病理参数的关系

综上所述，被视为T细胞活化标志的CD69、HLA-DR在结直肠癌围手术期表达水平能反映出机体免疫功能，检测二者表达水平有助于判断患者病情，进一步指导免疫治疗。

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Expression and significance of CD69 and HLA-DR in T lymphocytes of peripheral blood in perioperative period of patients with colorectal cancer

WANGXiang'an1,WUQiong,YULiming,ZOUZhenhong,CAILei,XIONGNi,YANGGang

(1TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the expression changes and significance of CD69 and HLA-DR in T lymphocytes of peripheral blood in perioperative period of patients with colorectal cancer. MethodsFlow eytometry was used to detect the expression of CD69 and HLA-DR in T lymphocytes of peripheral blood in 40 cases of perioperative period (including the preoperative and postoperative 5, 10 days) of patients with colorectal cancer (observation group), and in 15 cases of healthy persons (control group). The relationship of their expression with clinicopathologic features was analyzed． ResultsThe expression of CD69 and HLA-DR before surgery was significantly lower in the observation group than that of the control group (P<0.05), with further increase after surgery (P<0.05). The expression of HLA-DR was related with lymph node metastasis, distant metastasis and TNM stage after surgery (P<0.05), but was not related with the rest of clinicopathologic features (all P>0.05).ConclusionsThe expression of CD69 and HLA-DR before surgery in T lymphocytes of peripheral blood in the perioperative period of patients with colorectal cancer was significantly decreased, and gradually increased after surgery. The detection of CD69 and HLA-DR contributes to determining the state of an illness and guiding immune therapy for colorectal cancer.

Key words:colorectal carcinoma; perioperative period; T lymphocytes; CD69; HLA-DR

(收稿日期：2015-11-14)

中图分类号：R735.3

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)13-0007-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.003

通信作者简介：杨刚(1957-)，男，主任医师，硕士生导师，主要研究方向为大肠癌基础研究及诊治。E-mail：ygrealtom@sohu.com

第一作者简介：王祥安(1988-)，男，硕士，主要研究方向为胃肠道肿瘤研究及诊治。E-mail：wangxiangan1988@163.com

基金项目：江西省卫生厅科技计划项目(20141081)。