自体富血小板血浆联合低分子肝素对吸入性损伤大鼠治疗效果的研究

罗志军　陈杏绮　王和庚　田举

528403　广东省中山市人民医院烧伤整形科



·论著·

自体富血小板血浆联合低分子肝素对吸入性损伤大鼠治疗效果的研究

罗志军陈杏绮王和庚田举

528403广东省中山市人民医院烧伤整形科

【摘要】目的探讨自体富血小板血浆(PRP)联合低分子肝素(LMWH)治疗吸入性损伤大鼠的治疗效果。方法选取SPF级健康雄性Wistar大鼠48只，随机分为正常组、模型组、单用组、联合组，每组12只，模型组、单用组和联合组均建立烟雾吸入性损伤大鼠模型，模型组、正常组气管内滴入0.9%氯化钠溶液，单用组致伤后气管内滴注PRP液、联合组致伤后气管内滴注PRP和LMWH混合液。结果模型组、单用组、联合组的肺组织含水量显著的高于正常组(P<0.05)，联合组的肺组织含水量显著的低于模型组和单用组(P<0.05)； 模型组、单用组、联合组的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、PDGF显著高于正常组(P<0.05)，联合组的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、PDGF显著的低于模型组和单用组(P<0.05)；模型组、单用组、联合组的肺组织Brdu免疫组化阳性标记指数显著的高于正常组(P<0.05)，联合组的肺组织Brdu免疫组化阳性标记指数显著的高于模型组和单用组(P<0.05)。结论PRP联合LMWH治疗吸入性损伤大鼠能够显著的减轻肺水肿及炎性反应。

【关键词】自体富血小板血浆；低分子肝素；吸入性损伤；治疗结果

吸入性损伤作为一种兼有热力及化学物质的损伤，多见于封闭的火灾现场，由于吸入性损伤具有隐蔽性及严重性，是导致火灾死亡的主要原因之一[1]。自体富血小板血浆(PRP)内含有多种能促进组织修复和再生的生长因子，血小板衍生因子(PDGF)和转化生长因子-β(TGF-β1)制成凝胶状后，可用于修补组织缺损，并在局部能较长时间保持较高的生长因子浓度[2]。低分子肝素具有抑制炎症、调节免疫、抗凝以及改善微循环等多种作用。本研究对PRP联合低分子肝素(LMWH)治疗吸入性损伤大鼠的治疗效果进行探讨，报告如下。

1材料与方法

1.1实验动物选取SPF级健康雄性Wistar大鼠48只，随机分为正常组、模型组、单用组、联合组，每组12只。体重200～250 g，平均体重(221±11)g；喂养于光照12 h、相对湿度40%～60%、温度23～25℃、自由进食进水的环境中。

1.2造模方法100 g干燥的松木木屑以及约30 ml煤油混匀，制作成发烟材料后以铁制器皿盛装放于高压锅内电炉上，接通电源并预热15 ～20 min，使锅内温度逐渐上升到85～90℃。控制烟箱的温度在40℃左右，将大鼠放入烟箱内。按下放烟键，使烟箱内充满烟雾，大鼠自行吸入烟雾10 min后取出，间隔2 min后再次放入10 min后观察情况。伤后大鼠自由摄食饮水。

1.3实验方法4组大鼠气管内滴入的液体总量为2 ml/kg，4组大鼠分别于致伤72 h后取右肺做肺组织干湿比，左肺做组织病理切片和BrdU免疫组化观察肺上皮细胞的增生情况。模型组、正常组气管内滴入0.9%氯化钠溶液，单用组致伤后气管内滴注PRP液、联合组致伤后气管内滴注PRP和LMWH混合液。4组鼠于伤后8 h腹腔内注射Brdu 100 mg/kg，72 h后活杀，取右肺称重后置于80℃的恒温烤箱中48 h取出，肺含水量=(肺湿重-肺干重)/肺干重；取左肺置于10%的甲醛溶液中固定，石蜡包埋并制成切片后，加入Brdu单克隆抗体以及生物素化山羊抗小鼠抗IgG，DAB显色后使用显微镜进行观察，细胞溶胶中出现棕黄色物质且其染色强度高于背景的非特异性染色者为阳性细胞。

1.4观察指标对比4组实验动物大鼠肺组织的含水量、肺组织中Brdu免疫组化阳性标记数(阳性标记指数=阳性细胞数/细胞总数×100%)、血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、PDGF的水平差异。

1.5检测方法IL-6、IL-1β、TNF-α的测定采用酶联免疫吸附法，试剂盒为美国RB生物技术有限公司生产，操作方法严格按照说明书进行。PDGF的检测采用免疫比浊法，试剂盒由广州恒升科技实业有限公司生产，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

2结果

2.1病理学观察正常组大鼠的肺组织HE染色病理学观察可见肺泡完整、光滑、无炎症细胞及红细胞聚集浸润；模型组大鼠可见肺泡壁增生、破裂破坏严重，肺泡内大量的炎症细胞浸润、红细胞大量聚集；单用组和联合组的肺泡破坏程度显著的减轻较模型组，同时炎症细胞浸润、红细胞聚集现象减少。见图1。

正常组模型组单用组联合组

图14组大鼠肺组织病理观察(HE×200)

2.24组大鼠肺组织含水量测定模型组、单用组、联合组的肺组织含水量显著的高于正常组(P<0.05)，联合组的肺组织含水量显著低于模型组和单用组(P<0.05)。见表1。

表14组大鼠肺组织含水量测定

组别肺组织含水量F值P值正常组3.389±0.88719.863<0.05模型组6.704±1.392*单用组5.118±0.925*联合组4.096±0.895*#△

注：与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05；与单用组比较，△P<0.05

2.34组大鼠血清细胞因子水平测定模型组、单用组、联合组的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、PDGF显著高于正常组(P<0.05)，联合组的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、PDGF显著低于模型组和单用组(P<0.05)。见表2。

表2　4组大鼠肺血清细胞因子水平测定　±s

注：与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05；与单用组比较，△P<0.05

2.44组大鼠肺组织Brdu免疫组化阳性标记指数比较模型组、单用组、联合组的肺组织Brdu免疫组化阳性标记指数显著高于正常组(P<0.05)，联合组的肺组织Brdu免疫组化阳性标记指数显著高于模型组和单用组(P<0.05)。见表3。

3讨论

吸入性损伤后，由于烟雾产生的热力及化学物质颗粒导致气道黏膜及肺毛细血管内皮细胞损伤的直接损伤，但吸入性损伤导致的肺毛细血管微血栓形成，血管通透性增加以及大量液体外渗引起的肺水肿，可直接影响肺内血氧交换，进而导致低氧血症以及急性肺损伤，严重可导致急性呼吸窘迫综合征[3，4]。吸入性损伤后，大量异物颗粒被吸入并造成血管内皮的损伤，肺脏处于高凝状态，并产生大量的凝血酶进而诱导血小板活化因子、E-选择素及P-选择素的表达，进而促进血小板及中性粒细胞的黏附和聚集，进而促进炎症的进一步加重[5]。早期炎性反应中，TNF-α、IL-6等炎性细胞及炎性介质被大量释放入机体中，并激活内皮细胞及多核白细胞，补体、凝血及纤溶系统被激活，肺泡局部过度炎性反应，进而导致肺损伤[6]。因此，在损伤的早期及时应用肝素及抗炎药物可明显减轻肺脏的炎症损伤。

表3　4组大鼠肺肺组织Brdu免疫组化阳性标记指数比较　±s

注：与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05；与单用组比较，△P<0.05

PRP是通过离心分离自体全血而得到的血小板浓缩物，研究表明，富血小板血浆具有促进骨折愈合及骨缺损的修复与重建的作用[7]。PRP不仅含有高浓度的血小板，还富含有多种能促进组织修复和再生的生长因子，如：小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGFs)Ⅰ和Ⅱ、转化生长因子(TGF)β1和β2以及表皮生长因子等[8,9]。PDGF和TGF-β1制成凝胶状后，可用于组织缺损的修补治疗中，并在局部能较长时间保持较高的生长因子浓度[10]。低分子肝素作为一种由普通肝素分解合成的抗凝药物，具有选择性的抗凝血因子Ⅹa的作用，但对其他凝血酶及凝血因子作用较小，因此其抗血栓作用和致出血作用分离，进而降低了出血风险[11]。本研究结果显示，模型组、单用组、联合组的肺组织含水量显著的高于正常组，联合组的肺组织含水量显著的低于模型组、单用组。上述研究结果显示，自体富血小板血浆联合低分子肝素气道内给药可以降低吸入伤后肺组织内的含水量。模型组、单用组、联合组的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、PDGF水平显著高于正常组(P<0.05)，联合组的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、PDGF显著的低于模型组、单用组(P<0.05)；模型组、单用组、联合组的肺组织Brdu免疫组化阳性标记指数显著的高于正常组(P<0.05)，联合组的肺组织Brdu免疫组化阳性标记指数显著的高于模型组、单用组(P<0.05)。上述研究结果提示，自体富血小板血浆联合低分子肝素气道内给药既可以减轻大鼠吸入性损伤后肺组织的含水量，减少肺组织内TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性细胞和炎性介质的含量，进而间接的促进肺上皮细胞的增殖与修复。分析其原因可能与自体富血小板血浆中富含的生长因子可直接促进吸入性损伤后肺血管上皮细胞的修复与增殖。自体富血小板血浆联合低分子肝素气道内给药仅作用于肺脏局部，全身作用较小，方法安全有效，并可减少患者的经济负担和精神负担[12]。

综上所述，PRP联合LMWH治疗吸入性损伤大鼠肺能够显著的减轻肺水肿及炎性反应，值得临床应用和推广。

参考文献

1罗杰,郭光华,朱峰,等.高频振荡通气联合呼气末正压递增法对烟雾吸入性损伤犬心肌缺血缺氧和心肌细胞凋亡的影响.中华烧伤杂志,2015,31:259-263.

2朱峰,郭光华.间充质干细胞治疗吸入性损伤的实验研究进展.中华烧伤杂志,2015,31:238-240.

3徐剑锋,郭芝廷,毛越,等.集束化呼吸治疗在烧伤合并中重度吸入性损伤患者气道管理中的应用.中华烧伤杂志,2015,31:140-142.

4朱富军,詹球,童亚林,等.不同层级重度蒸汽吸入性损伤动物模型的建立.中华损伤与修复杂志,2015,27:152-159.

5李红英.重度吸入性损伤呼吸机辅助患者应用碳酸氢钠溶液不同浓度清洗的护理及效果.航空航天医学杂志,2015,14:888-891.

6姜毅,韩志海,黄燕,等.大鼠棉花烟雾吸入性肺损伤中的氧化应激.国际呼吸杂志,2015,35:436-439.

7蔡卫林,郭明锋.富血小板血浆对创面修复作用的研究进展.中华创伤杂志,2015,31:766-768.

8尤家聪.强化抗血小板治疗对PCI术后QT离散度的影响.现代仪器与医疗,2013,19:53-55.

9Hoon D,Lee KJ,Ryu J,et al.Bone marrow aspirate concentrate and platelet-rich plasma enhanced bone healing in distraction osteogenesis of the tibia.Clinical Orthopaedics and Related Research,2014,472:3789-3797.

10肖青.氯吡格雷联合低分子肝素钙治疗短暂性脑缺血发作的临床疗效.现代仪器与医疗,2014,20:75-77.

11Filomia C,Ventura A,Crescibene J, et al.Treatment of pilonidal sinus disease with autologous platelet-rich plasma.Giornale italiano di dermatologiae venereologia:organo ufficiale,Società Italianadi.Dermatologiae Sifilografia,2013,148:704-706.

12吴宏志,杨蒙,魏伟,等.自体富血小板血浆凝胶治疗电烧伤残余创面的疗效观察.海南医学院学报,2015,21:96-98.

Experimental study on the therapeutic effects of autologous platelet rich plasma combined with low molecular weight heparin on inhalation pulmonary injury in rats

LUOZhijun,CHENXingqi,WANGHegeng,etal.

DepartmentofBurnandPlasticSurgery,People’sHospitalofZhongshanCity,Guangdong,Zhongshan528403,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the therapeutic effects of autologous platelet rich plasma (PRP) combined with low molecular weight heparin (LMWH) on inhalation pulmonary injury in rats.MethodsForty-eight healthy rats (SPF grade) were randomly divided into control group,model group,with 12 rats in each group.The animal models with smoke inhalation pulmonary injury were established in rats of model group, single-use group and combination group,and the rats in model group and control group were given 0.9% sodium chloride solution by intratracheal instillation, however,after smoke inhalation pulmonary injury the rats in single-use group were given PRP liquor by intratracheal instillation,but the rats in combination group were given mixed liquor of PRP with LMWH by intratracheal instillation.ResultsThe water content of lung tissues in model group,single-use group, combination group was significantly higher than that in control group (P<0.05),moreover, which in combination group was significantly lower than that in model group and single-use group (P<0.05).The serum levels of TNF-α,IL-6,IL-1β,PDGF in model group,single-use group, combination group were significantly higher than those in control group (P<0.05),however, which in combination group were significantly lower than those in model group and single-use group (P<0.05). The Brdu positive immunohistochemical labeling indexes in model group,single-use group, combination group were significantly higher than those in control group (P<0.05), furthermore, which in combination group were significantly higher than those in model group and single-use group (P<0.05).ConclusionPRP combined with LMWH can obviously alleviate pulmonary edema and inflammation reaction in treatment of inhalation pulmonary injury in rats.

【Key words】autologous platelet-rich plasma; low molecular weight heparin; inhalation injury;therapeutic effects

(收稿日期：2015-12-14)

【中图分类号】R 563

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)09-1300-03

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.09.005

项目来源：中山市科技计划项目(编号:20122A038)