不同2型糖尿病肾病模型建立方法及成模特点比较

闫永恒，李渐鹏，刘战伟，徐志祥，王新春，徐同成，邱　斌，刘振华，杜方岭(山东省农业科学院农产品研究所，济南　5000;山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安　7000;济南诚汇双达化工有限公司，济南　500)



不同2型糖尿病肾病模型建立方法及成模特点比较

闫永恒1，2，李渐鹏1，刘战伟3，徐志祥2，王新春2，徐同成1，邱斌1，刘振华1，杜方岭1
(1山东省农业科学院农产品研究所，济南250100;2山东农业大学
食品科学与工程学院，山东泰安271000;3济南诚汇双达化工有限公司，济南250101)

摘要:综述不同的2型糖尿病肾病建模方式并进行比较，以方便实验者根据实验目的、实验室条件及经验等，从中选择出适合的建模方式，为2型糖尿病肾病的预防和治疗提供科学依据。

关键词:2型糖尿病肾病;动物模型;链脲佐菌素

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常见的微血管并发症，病因和发病机制目前尚不明确，研究成果提示为代谢紊乱、炎性反应机制、氧化应激、血流动力学改变、细胞因子、遗传因素及自噬等多种因素共同导致了糖尿病肾病的发病［1］。糖尿病肾病发病不可逆，在服药之外需要医学营养治疗的有效辅助，即通过调整营养素结构来起到控制血糖、维持理想体重和预防营养不良发生的作用。根据2013年版《中国2型糖尿病防治指南》，中国患病人群中2型糖尿病占90.0%以上［2］。由于我国城市化进程加快、老龄化水平上升、国民生活方式转变加之肥胖和超重的比例上升，短期内我国糖尿病患病率急剧增加，对社会医疗卫生服务成本造成巨大压力，因此对于2型糖尿病预防与治疗手段的完善进程亟需加快。

从Minkowski和Von Mehring用切除狗胰腺的方法建立糖尿病模型以来，随着糖尿病研究范围的扩大，使用的实验动物种类也逐渐增多，如主要用于遗传学、病因学、神经学系统研究的灵长类动物猕猴等哺乳动物［3］和主要用于药物筛选、血液生化、发病机制研究的大鼠等啮齿类动物模型。其中鼠科动物因具有体积小、易繁殖、饲养条件要求低、饲料喂养依从性高、起病迅速等优点成为公认的诱导糖尿病肾病的理想模型。大鼠模型的建立模拟了2型糖尿病初期病理，为发病机理的进一步研究，探索有效的降低糖尿病肾病发病风险的生活干预方式提供了可能。国内外学者长期尝试建立大鼠糖尿病肾病模型的过程中，选用了不同的品种和途径，然而，现阶段普遍认可及应用最广的建模方式质量参差不齐，有成功率低、成功可复制率较低、成模标准未确立、耗时较长、无法兼顾高效和低廉及模型无法模拟人类糖尿病肾病后期病理等桎梏，本文旨在系统总结不同的糖尿病肾病建模方式并进行比较，以方便实验者根据实验目的、实验室条件及实验经验，从中选择出较为合适的建模方式。

1　自发性2型糖尿病肾病模型

2型糖尿病发生糖尿病肾病所占比例较高，是现阶段医学研究热点之一，因此研究的自发性模型也相对较多，现简述应用较多的几种自发性2型糖尿病肾病模型特点及应用现状(附表)。

自发性模型鼠虽然在一定程度上模拟了人类糖尿病肾病发病存在的遗传性因素，但仍有自身桎梏。一方面，由于发病过程中遗传因素占比巨大，导致这些动物模型后期饲养方式转变对病变影响较小，也无法兼顾人类发病的生活方式影响因素。另一方面，虽然对于不同单一品种的自发性2型糖尿病模型的研究均显示其具有典型的糖尿病肾病病理改变［4-8］，但不同模型鼠之间的横向比较较少，导致部分实验者在选择自发性模型时出现困惑。李娜等［9］在对自发性2型糖尿病KK-Ay/Ta和C57BL/KsJ-db/db小鼠比较后发现，品系的差异导致发病时间和异常持续时间均有不同，实验者须根据具体实验倾向选择模型。最后，自发性2型糖尿病动物模型建立标准并不统一，往往获得渠道狭窄，因为遗传性病变导致存活时间短且不能生育，价格昂贵，日常实验需要耗时地进行回交诱导突变来测试病理生理过程，不适用于大规模饲养探索。

附表　几种自发性2型糖尿病肾病模型特点

2　诱导性糖尿病肾病模型

2.1实验动物的选择

诱导性建模常用大鼠品系以Wister和SD为主。陈枫等［10］对比SD大鼠和Wistar大鼠成模成功率后发现，Wistar大鼠成模率高、死亡率低且成模后体征表现优于SD大鼠。王晓琳等［11］在对比不同性别的Wistar大鼠建模结果后，得出雄性大鼠对链脲佐菌素(STZ)敏感程度高于雌性大鼠。陈静等［12］选取7～9w龄雄性SD大鼠35只探讨大鼠体质量对1型糖尿病造模成功率的影响，发现体质量180～240g大鼠糖尿病成模率较高，随着体质量的增加，成模率会降低，死亡率增大。综上所述，7～9w 180～240g的雄性Wistar大鼠是较为理想的2型糖尿病肾病的动物模型。

2.2实验试剂

在诱导性模型建立过程中，链脲佐菌素(STZ)是不可或缺的关键试剂也是最关键的一环。在糖尿病肾病的发生和发展中，胰岛β细胞生存状态起关键性的作用［13］。STZ作为一种DNA烷基化试剂，能通过GLUT2葡萄糖转运蛋白(GLUT2 glucose transport protein)独自进入细胞，对胰腺胰岛胰岛素诱发的β－细胞具毒性。需要注意的是，随着STZ诱导的糖尿病给药方式不同，其成模效果上也随之带来差别。刘长青等［14］采用pH4.5柠檬酸磷酸盐缓冲液(PBS)、pH 5.5、pH 7.0 Hanks，及pH 7.0生理盐水4种溶剂溶解STZ对小鼠腹腔注射，观察溶剂类型及其酸碱度对模型成功率的影响，发现pH 4.5柠檬酸造模成功率最高，有借鉴意义。模型制作的另一个关键是STZ溶液的保存及应用，特别是柠檬酸磷酸盐缓冲液浓度及PH值要符合要求，溶液应充分混匀，避光保存。现配现用，最好在配制后10min内注射完毕。注射药物后48h后，模型鼠即可出现血糖升高，饮水量、尿量增加，故给予充足水分和食物动物密度不宜过大，通风要好，防止相互撕咬及各种感染，在有创操作时注意局部消毒。

2.3模型建立方式

实验室诱导模型基于实验条件和操作技术不同的影响，发展出若干不同的糖尿病肾病模型建立方式。以链脲佐菌素为主的注射定向破坏胰岛β细胞，并在此基础上做出不同的优化与改进，成为现在被广泛接受的造模主要方式。

2.3.1单纯腹腔注射在模型建立方法方面，无论哪种模型建立方法，STZ溶液都扮演着至关重要的角色。STZ注射剂量问题是模型建立的关键。在注射方式上，沈亚非等［15］对比了尾静脉注射和腹腔注射链脲佐菌素，发现两者都可以建立标准的糖尿病肾病模型，但尾静脉注射较难掌握，易出现操作误差，腹腔注射较易操作、准确。在注射剂量上，李伟等［16］对比注射40、50、60、70mg/kg的STZ成模率和死亡率以后，得出注射60mg/ kg的STZ是致SD大鼠发生糖尿病肾病的最佳剂量的结论。李光辉等［17］对比注射55、65、75mg/kg的STZ成模率和死亡率以后，得出注射65mg/kg的STZ注射方式具有成模率高、病死率低、感染率低的优点。

上述实验者结论均为高剂量STZ注射有利于建模，却均未完全考虑STZ对胰岛β细胞的强靶向作用，导致胰岛素急剧下降，结果更接近于对于建立1型糖尿病模型，而非2型糖尿病模型。所以我们在建立2型糖尿病肾病模型时，不宜采用大剂量STZ注射。因此，陈枫等［10］对比55、45、35、25mg/kg不同剂量STZ造模的成功率和死亡率后，所提出的建立2型糖尿病肾病模型注射STZ 35mg/kg的最优剂量是更为合理的。现今报道也有采用多次小剂量STZ的注射代替一次大剂量注射的方法，以减少STZ对肾脏的过大毒性作用。STZ溶液基本要求是现配先用，故而实验室条件不同，配置到注射时间间隔不同都有可能造成造模效果的差异。

2.3.2链脲佐菌配合单肾切除(结扎)该方法是在大鼠禁食12h后进行腹腔注射3%的戊巴比妥钠进行麻醉，从左侧脊柱与肋骨相交处稍下方切开皮肤及肌层，暴露肾脏，选择性摘除左肾或于肾门处结扎，缝合肌层和皮肤，术后4w，禁食12h，再进行小剂量STZ溶液的腹腔注射。单侧肾脏切除导致保留的肾脏代偿性肥大、高过滤，肾小球毛细血管压力增大，促进糖尿病肾小球损伤。邢淑丽等［18］通过腹腔注射链脲佐菌素45mg/kg(冬季)和35mg/kg (夏季)联合单侧肾脏切除成功制造出稳定性强、可复制性高的大鼠DN模型，可以看到该方法从致病原理和注射剂量控制上都是较为合适的。李世芬等［19］比较了腹腔STZ注射配合单肾切除与腹腔STZ注射配合单肾结扎两种造模方法，发现2种造模方法在模型成立上无较大差别，操作难度相同，随病程加长不排除单肾切除存活率低于单肾结扎的可能，故而建议实验者在考虑此类方法时采取单肾结扎方式。该方法未能广泛普及的原因有三点:一是对于实验者经验要求较高，手术过程繁琐;二是单侧肾脏切除后造成的健侧肾脏的代偿性增生并不完全符合人类2型糖尿病肾病疾病发展特点;三是模型鼠相对于传统腹腔注射死亡率升高。

2.3.3链脲佐菌素配合高脂高糖饮食研究表明，由胰岛素代谢障碍而导致的高血糖是DN发生的最关键原因，饮食中蛋白含量过高是DN的危险因素，脂代谢紊乱亦是DN发生的一项独立的影响因素。芝敏等［20］比较不同饮食结构建立2型糖尿病肾病大鼠模型时发现，高糖高脂可导致糖尿病肾病大鼠更为明显的高血压和更加严重的微量白蛋白尿，且等易导致肾小球硬化，病理损害相对较重。故而STZ注射配合高脂高糖饮食法既继承了高脂高糖法对于人类生活习惯的模拟性并诱导出胰岛素抵抗，又加以注射STZ引起β细胞受损并诱发胰岛素代偿性分泌障碍，大大缩短了建模速度，同时与单侧肾切除相比对实验者技术要求低，建模过程中动物模型死亡率低，成为目前运用最广泛的方法。建模通用标准高糖高脂饲料:蔗糖10%、猪油10%、植物油10%、胆固醇5%、普通基础饲料65%、另有0.2%胆盐以促进对脂肪吸收。

董建一等［21］采用高脂饲料喂养4w加一次性注射25mg/kg的STZ溶液的方法探索建立2型糖尿病肾病模型，成模率仅为67%且模型不稳定。郭俊秀等［22］对该方法合理性进行了验证，通过高脂高糖饲养6w后，一周一次共两周的30mg/kg的STZ腹腔注射，建立起了稳定的大鼠糖尿病肾病的模型。证明了高脂高糖联合STZ注射法是理想的造模方法。

需要注意的是，在高脂高糖饮食阶段，高脂高糖饲养会造成强饱腹感，引起实验动物进食量的减少，导致胰岛素抵抗现象出现缓慢、血糖升高不明显。对此，林琼等［23］对原有方式进行了改良，即高糖高脂饲料喂养+5%葡萄糖水饮水，一方面加速胰岛素抵抗的出现(2w)，另一方面，高糖引起渗透性利尿也有加速肾脏损伤的作用。另外通过连续3d小剂量腹腔注射STZ (30mg/kg)，避免了一次性注射高剂量STZ导致的诱导1型糖尿病倾向和动物模型死亡，同时也减少了STZ本身的肾毒性所造成的肾脏损害。

2.3.4链脲佐菌素注射配合高糖高脂饮食合并单肾切除Mikio S等［24］为加速糖尿病肾脏病损伤的出现，采取用40mg/kg的STZ溶液静脉注射加切除右肾，手术后2w再喂以高糖高脂饮食的方法。这种在高糖高脂饲养+腹腔注射小剂量STZ的基础上进行单侧肾脏切除的方式建立糖尿病肾病模型的方法又称“三联法”，它结合了运用最优的建模因素:单侧肾切除引起肾脏代偿性肥大，链脲菌素注射耗损胰岛B细胞，高脂高糖模拟人类致病因素。一方面，三联法的优势在于大大缩短了造模用时，且造模的成功率以及成模后的稳定性，病理改变的显著性，蛋白尿的严重性也较单纯的小剂量STZ加高脂或STZ加单侧肾切除实验方案更加优越。但另一方面，我们无法忽略这种方法的不足——合并了上述种种造模方式的短板，特别是实验流程上的繁琐，使大多实验者望而却步。

2.4成模标准

多年来，对于2型糖尿病肾病成模标准一直存在诸多差异，这些差异或会导致研究结果的可借鉴意义和可重复性大大下降。现在最普遍的成模标准为，开始72h后至少连续3d尾静脉检测血糖为基，以连续3次血糖＞16.65mmol/尿糖强阳性;尿量大于对照组的50 %的标准判定是否建模成功。上述标准虽被广泛接受却也存在问题:汪峰等［25］在对于链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型稳定性进行探讨时发现，腹腔注射STZ溶液3w后有30%的大鼠模型空腹血糖值回到正常水平，这表示模型建立时存在不稳定的可能，所以提出参照目前的72h模型判定方式无法囊括造模不稳定现象，建议采用腹腔注射STZ后第3w空腹血糖值≥16.7为模型建立新标准。曾玉琴等［26］通过OGTT葡萄糖耐量实验方式筛选成模大鼠。郭学军等［27］发现，在有明确胰岛病理改变的模型组大鼠中OGTT异常阳性率显著高于空腹血糖异常阳性率，提出在动物实验中OGTT比空腹血糖监测更有诊断意义，不易造成漏诊。另外，在判断DN模型是否成功时，从源头实验动物的选择到造模结束后动物模型基础指标(包括血压、血糖、血肌酐、血尿素氮、尿蛋白定量等)的检测方法的标准化均需要引起实验者们的重视。

3　结论与讨论

第一，自发性的动物模型和诱发性的动物模型在一定程度上共同模拟了临床糖尿病肾病的症状，包括胰岛素抵抗、高血糖、高血脂等，但两种模型的应用价值却不尽相同。诱发性糖尿病小鼠模型相比，自发性动物模型由于其存在遗传因素作用，糖尿病肾病的产生与临床患者更为相似，应用价值更高。如db/db小鼠是由于瘦素(leptin)受体基因缺陷失去功能，在出生后2w内就发生高胰岛素血症，3～4w发展为肥胖，8w后就发展为非常严重的高血糖症，期间伴有胰岛素抵抗，β细胞功能衰竭，一般在8～10个月内死亡，可发生明显的肾病［28］。但是自发性模型相较于普通诱导鼠类模型的获得渠道更为狭窄，成本较高，故而运用未似诱发性模型广泛。诱发性的动物模型则更强调了后天成长因素，与现代社会普遍不科学饮食和不健康生活方式相近，但亦有其缺点:首先，其忽略了DN发病的遗传因素;其次，其存在造模时间偏长、稳定性不足的问题;最后，多数建模成功产生了血糖升高等类似2型糖尿病的症状后，模型体型缺与正常小鼠体型差异无显著性，未出现肥胖现象。2种小鼠模型都存在一定的优点与缺陷，研究者可根据实际需要参照相关数据进行选择。

第二，在模型建立方法方面。胰岛素抵抗是2型糖尿病最显著的特征，有无胰岛素抵抗也是区别1型和2型糖尿病肾病动物模型的标准［29］。1型糖尿病的病理生理学和病理学特征是胰岛B细胞数量显著减少和消失所导致的胰岛素分泌显著下降或缺失，表现为起病迅速，中度至重度的临床症状。由此可见2型糖尿病与1型糖尿病主要区别在于: 2型糖尿病较1型糖尿病胰岛细胞破坏程度轻，发病速度慢，所以STZ注射法建立2型糖尿病一定要控制剂量，否则将有建模发展成1型糖尿病的可能性。有研究表明STZ对于肾脏损害是可叠加性的，所以实验者在糖尿病肾病建模过程中，在一次注射失败情况下，采用二次补注的方法的合理性有待商榷。

第三，实验动物的存活是模型建立的前提，但糖尿病肾病模型建立过程容易发生动物死亡，王彦江等［30］探讨了STZ诱导糖尿病大鼠造模过程中模型鼠的死亡原因，发现模型鼠的死亡可能与实验操作过程中感染、大鼠自身营养不良、淋巴循环受阻、STZ本身的毒性以及环境气候条件的变化有关，实验者在实验过程中应对以上因素加倍注意。

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(责任编辑李婷婷)

Comparison of Different Modeling Methods and Characteristics of Type 2 Diabetic Nephropathy Rat Model

YAN Yong-heng1，2，LI Jian-peng1，LIU Zhan-wei3，XU Zhi-xiang2，WANG Xin-chun2，XU Tong-cheng1，QIU Bin1，LIU Zhen-hua1，DU Fang-ling1
(1Institute of Agro-Food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Science，Jinan 250100，China;2College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai'an 271000，China)

Abstract:We summarized different modeling methods of type 2 diabetic nephropathy to facilitate the experimenters to choose suitable modeling methods according to the laboratory conditions to provide scientific basis for the prevention and treatment of tyre 2 diabetic nephropathy．

Keywords:type 2 diabetic nephropathy; animal model; STZ

通讯作者:杜方岭(1972—)，男，硕士，研究员，研究方向:特殊医学用途配方食品。

作者简介:闫永恒(1992—)，女，在读硕士研究生，研究方向:特殊医学用途配方食品。

基金项目:国家自然科学基金(项目编号: 31401487) ;山东省农业科学院科技创新重点项目(项目编号: 2014CXZ03)。