酶解法制备甲鱼油工艺研究

陶轶松，吴芮，包建强

(上海海洋大学 食品学院，上海，201306)



酶解法制备甲鱼油工艺研究

陶轶松，吴芮，包建强*

(上海海洋大学 食品学院，上海，201306)

摘要运用酶解法从甲鱼四肢根部的脂肪中提取甲鱼油，利用单因素实验与响应面结合的方法，得到优化的工艺条件：酶解温度61 ℃，酶添加量1.25 %、料液比1∶1.5、酶解时间2.5 h。通过此方法得到的提取率为76.3%。再利用脱胶、脱酸、脱臭和脱色四步精制方法将甲鱼油进行精制，并对其理化指标和脂肪酸组成进行分析。测得的精制甲鱼油的理化指标均符合国家精制鱼油一级标准，且测得的脂肪酸共33种，其中不饱和脂肪酸含量高达78.13%。

关键词甲鱼油；精制；脂肪酸

中华鳖，又名甲鱼，是我国特色水产品，它营养丰富，味道鲜美，是传统食材。随着20世纪90年代养殖技术的成熟，从1995年的1.9万t到2014年的34.12万t[1]，我国甲鱼养殖产量突飞猛进。我国甲鱼消费市场很大，在宰杀过程中会产生内脏、脂肪等废弃物。这些废弃物不仅会污染环境，同时也是资源浪费，充分利用这些废弃物成为未来甲鱼开发的一个热点。

陆生动物脂肪中含有的不饱和脂肪酸远比水生动物脂肪中要少，TAPIERO等人[2～7]发现，不饱和脂肪酸具有降低体内胆固醇、降低血黏度、软化血管、增加血液的循环等功效。现今，提取甲鱼油的方法主要有蒸煮法、稀碱法、超临界CO2萃取法、酶解法等[8-14]。传统的方法在提取过程中常常会破坏一些成分，影响甲鱼油的品质[15-16]。酶解法是利用蛋白酶对蛋白质的水解，破坏蛋白质和脂肪的结合，从而使油脂释放出来。该方法作用条件温和，产油质量高，是提取水产品下脚料中鱼油的较好方法[17]。因此，本研究使用酶解法制备甲鱼油，优化工艺条件，采用精制的方法将提取到的甲鱼油进行精制，同时测定其理化指标及脂肪酸组成。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1原料与试剂

原料：甲鱼的四肢根部成块状的黄色脂肪块；碱性蛋白酶、中性蛋白酶、肽酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶，上海辛森化学科技有限公司。

NaCl、NaOH、H3PO4均为分析纯级，14%三氟化硼-甲醇溶液、正己烷均为色谱级，国药集团化学试剂公司提供；37种脂肪酸甲酯混标，美国Supelco®公司提供。

1.1.2仪器与设备

SHIMADZU AUY220型电子分析天平，IKA® HB 10 数显型加热锅，DHG-9073BS-III型新苗恒温鼓风干燥箱，DK-S28型精宏水浴锅，TRACE GC ULTRA气相色谱仪，LXJ-IIB低速大容量多管离心机，检测器为FID(美国Thermo Fisher)。

1.2实验方法

1.2.1原料前处理

将原料活甲鱼进行宰杀，取出甲鱼身体中的脂肪，切割至2～3 mm的脂肪块大小，随后将脂肪块装入袋中，储藏在-50 ℃下备用。

1.2.2酶解法提取甲鱼油工艺流程

取出冻结甲鱼脂肪，在4 ℃下解冻，按照料液比1∶1.5 (g∶mL)加水，按中性蛋白酶添加量1.2%、酶解时间2.5 h、60 ℃下酶解，然后在4 500 r/min、20 min离心，得到上层粗甲鱼油。评判提取效果以甲鱼油提取率为依据。

1.2.3提取率的计算(公式(1))

(1)

1.2.4蛋白酶的筛选

在料液比为1∶1 (g∶mL)，根据不同蛋白酶的活性温度，以酶添加量0.8%分别加入碱性蛋白酶、中性蛋白酶、肽酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶，酶解3 h，评判提取效果以甲鱼油提取率高低为依据，且同时进行空白对照实验。

1.2.5鱼油提取工艺多因素条件优化

在单因素实验的基础上，采用响应面Design-Expert的实验设计，设计3因素3水平实验确定酶解法提取甲鱼油的最佳工艺条件，响应面的实验因素及水平如表1所示。

表1　因素水平编码表

1.2.6甲鱼油精制工艺

粗甲鱼油在70 ℃水浴中加热，向油中加入质量分数为1%的H3PO4溶液进行脱胶，离心，提取上层鱼油；脱胶鱼油在80 ℃水浴中加热，向油中加入质量分数为9%的NaOH 溶液(浓度为2.25 mol/L)进行脱酸，离心，提取上层鱼油；脱酸鱼油在50 ℃水浴中加热，加入质量分数为20%的活性白土，脱色20 min，随后离心，提取出上层鱼油；脱色鱼油在90 ℃水浴中加热，0.09 MPa旋蒸的条件下，旋蒸60 min最终得到精制甲鱼油。

1.2.7鱼油理化性质测定及脂肪酸组成

酸值(AV)：参照GB/T 5530—2005；过氧化值(POV)：参照GB/T 5538—2008；碘值：参照GB/T 5532—2008(韦氏法)；皂化价： 参照GB/T 5534—2008；不皂化物：参照GB/T5535.1—2008(乙醚提取法)；水分及挥发物含量：参照GB/T 5528—2008；油脂灰分：参照GB/T17375—2008。脂肪酸组成分析：参照GB/T 22223—2008测定。

2结果与分析

2.1蛋白酶种类的选取

从图1可知，空白试验由于未添加酶在所有提取率中是最低的，只有28.78%。在加入蛋白酶之后，甲鱼油提取率有明显的上升。由于不同蛋白酶对肽键的专一性不同，导致蛋白酶的水解能力不同[18],因此提取率也有显著性差异。其中中性蛋白酶提取率最高，达到72.37%。所以，选择中性蛋白酶提取甲鱼油。

图1　不同蛋白酶对甲鱼油提取率的影响Fig.1　Effect of different protease on oil extraction注：字母不同代表不同提取率之间存在显著性差异(P<0.05)

2.2单因素实验

2.2.1酶解时间对于提取率的影响

在酶添加量为0.8%，酶解温度60 ℃，料液比1∶1，酶解时间在0.5，1，1.5，2，2.5和3 h下的情况下，酶解时间对提油率的影响，根据甲鱼油提取率确定酶解时间，结果如图2所示。

图2　酶解时间对提取率的影响Fig.2　Effect of time of enzymatic hydrolysis on oil extraction rate

从图2可知，甲鱼油的提取率随着酶解时间的增加而增大，提取率的增长速率随着酶解时间的增加而减小。当酶解时间超过2.5 h时，提取率开始下降，并且甲鱼油的品质会随着酶解时间的增加而降低，甲鱼油暴露在空气中的时间越长，甲鱼油中的不饱和脂肪酸会被氧化的越多，从而影响甲鱼油的品质。所以，最适合的酶解时间为2.5 h。

2.2.2酶添加量对于提取率的影响

在温度60 ℃，料液比1∶1，酶添加量分别为0.4%，0.8%，1.2%，1.6%，2.0%，酶解2.5 h的情况下，酶添加量对提取率的影响结果如图3所示。

图3　酶添加量对提取率的影响Fig.3　Effect of enzyme dosage on oil extraction rate

从图3可知，随着酶添加量的增加，甲鱼油提取率表现出先上升后下降的特点。当酶添加量达到1.2%，提取率最高，达到72.99%。当酶添加量少的时候，主要是酶控制反应，当酶添加量多的时候主要是底物控制反应，当酶多的时候，酶会相互影响，妨碍酶对底物的水解作用。李梦凡[19]研究酶解法制备罗非鱼油时，随着酶添加量的增加，鱼油提取率也表现出先上升后下降的特点，这与其实验结果基本一致。因此，最适合的酶添加量为1.2%。

2.2.3料液比对于提取率的影响

在温度60 ℃，酶添加量1.2%，料液比(g∶mL)分别为1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2，1∶2.5，酶解2.5 h的情况下，料液比对提取率的影响，根据甲鱼油提取率确定酶添加量，结果如图4所示。

图4　料液比对提取率的影响Fig.4Effect of ratio of tilapia head to water on oil extraction rate

从图4可知，甲鱼油的提取率随着料液比的增加呈现出先上升后下降的趋势，当料液比达到1∶1.5的时候，提取率达到最大为75.24%。当在加入少量水的时候，底物中的酶分子分布不均匀，使底物和酶不能良好的接触，加水过多时，底物和酶分子接触机会降低，也会影响甲鱼油的提取率。因此，适合的料液比为1∶1.5。

2.2.4酶解温度对于提取率的影响

在酶添加量1.2%，料液比1∶1.5，酶解温度分别为45，50，55，60和65 ℃，酶解2.5 h的情况下，酶解温度对提取率的影响如图5所示。

图5　酶解温度对提取率的影响Fig.5　Effect of hydrolysis temperature on extraction yield

从图5可知，在60 ℃之前，随着酶解温度的升高，甲鱼油的提取率上升，在60 ℃的时候，取得最大值为75.72%，在60 ℃之后，甲鱼油提取率下降。温度对酶促反应较复杂，升温加速分子运动，但同时升温也会对酶的活性、最大反应速度及底物产生影响。因此，适合的酶解温度为60 ℃。

2.3甲鱼油提取工艺优化

2.3.1响应面优化结果

从单因素实验中得到酶解法提取甲鱼油的条件为：酶解时间2.5 h，酶添加量1.2%，料液比1∶1.5，酶解温度60 ℃。因为从单因素实验中获得酶解时间在2.5 h以后的甲鱼油提取率趋于接近，所以固定酶解时间2.5 h。因此选择酶解温度(A)、酶添加量(B)和料液比(C)3个因素设计响应面实验。响应面方案设计及结果见表2。

表2　响应面分析方案及实验结果

通过Desingn-expert软件对表4中得到的提取率数据进行二次多元拟合，得到了提取率Y对A、B、C的二次多元回归方程:提油率(Y)= 75.72+3.73A+2.46B-0.35C-1.73AB+0.78AC+0.76BC-3.13A2-3.99B2-0.87C2。在方程中各项的系数的绝对值大小可以反应出各项因数对响应值的影响程度。各项系数的正、负可以反应影响的方向，由二次项的系数为负可以推断出方程式所代表的曲线开口向下，具有极大值，可以进行优化分析。回归方程的方差分析，如表3所示。

表3　回归模型系数检验

注：“*”为差异显著(P<0.05)；“**”为差异极显著(P<0.01)。

通过对表3的分析，此模型极显著(P<0.01)，失拟项不显著(P>0.05)，说明此模型建立成功，可用此模型分析和预测甲鱼油提取率。RAdj2=0.9439说明该模型拟合程度良好，实验误差较小，该模型是合理的；变异系数CV=1.44，CV较低说明实验具有较好的可靠性模型的相关系数R2=0.9755，表示回归方程中所有自变量的变化可以解释97.55%因变量的变化，表明回归方程可以很好地描述考察因子与响应值之间的关系。从表3回归系数显著性检验显示，酶解温度的一次项和二次项与酶添加量的一次项和二次项，影响都达到极显著水平(P<0.01)；酶解温度与酶添加量的交互项影响达到显著性水平(P<0.05)。由P值可知，各工艺因素对提取率影响大小依次为：酶添加量>酶解温度>料液比。同时根据回归方程得到最佳工艺参数为：酶解温度61.2 ℃，酶添加量1.24%，料液比1∶1.56，在此条件下的提取率为76.98%。

2.3.2验证实验

由该模型得到的最佳甲鱼油提取工艺参数为：酶解温度61.2 ℃，酶添加量1.24%，料液比1∶1.56，在此条件下的提取率为76.98%。从实际生产角度考虑，确定最佳鱼油提取工艺为：酶添加量1.25%，酶解温度61 ℃，料液比1∶1.5。在此条件下进行平行实验3次，所得到的提取率的平均值为76.3%，相对误差0.87%，与预测的结果基本一致。证明此模型能够很好的模拟并预测酶解法提取鱼油的得率，进一步的证明了此模型的可行性。

2.4甲鱼油的精制及理化

按照1.2.6工艺对甲鱼油进行精制。并对其进行理化指标测定，结果如表4所示。

表4　酶解法制备粗甲鱼油与精制鱼油理化性质

从表4中可知，甲鱼油在精制之前，其水分及挥发物，酸值，杂质都略高于国家二级标准。过氧化值，碘值，不皂化物都符合国家一级标准。

2.5甲鱼油的脂肪酸组成

参照GB/T 22223—2008测定，对甲鱼油脂肪酸组成进行分析，结果如表5所示。

表5　粗甲鱼油与精制甲鱼油脂肪酸组成

表5为酶解法制备粗甲鱼油与精制甲鱼油的脂肪酸组成分析，粗甲鱼油精制后脂肪酸组成变化不大，总体上单不饱和脂肪酸(MUFA)所占比例最高的是油酸，多不饱和脂肪酸(PUFA)以亚油酸为主，EPA与DHA的总比例均约为9.7%，油酸、EPA等所占脂肪酸比例与韩玉谦[19]、吴惠勤[20]等人测定比例相似，而DHA、亚油酸含量相对较高。

精制甲鱼油中不饱和脂肪酸UFA(78.13%)含量丰富，其中MUFA占到总量的50.52%，而PUFA占到总量的27.61%。还含有人体必需脂肪酸α-亚麻酸，亚油酸和花生四烯酸。PUFA对清除自由基，预防心血管疾病具有一定的功效[21]。

3结论

(1)通过对4种提取鱼油的方法进行比较可以发现，因为酶解法比超临界CO2萃取法成本低，且比蒸煮法以及稀碱法提油效果好，所以可以作为提取甲鱼油的理想方法。

(2)采用单因素结合响应面分析法对酶解工艺进行优化，得到鱼油提取率与各因素的二元多项回归方程：Y(%)=75.72+3.73A+2.46B-0.35C-1.73AB+0.78AC+0.76BC-3.13A2-3.99B2-0.87C2。确定最佳鱼油提取工艺条件：酶解温度61 ℃，酶添加量1.25%、料液比1∶1.5、酶解时间2.5 h，提取率为76.3%。

(3)粗甲鱼油经过精制得到精制甲鱼油。精制甲鱼油的的理化指标全部达到国家水产行业精制鱼油一级标准。精制的甲鱼油的脂肪酸组成共鉴定出33种脂肪酸，其中MUFA含量为50.52%,PUFA含量为27.61%，EPA+DHA含量为9.7%。

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Research of Chinese soft-shelled turtle oil by enzymatic hydrolysis

TAO Yi-song，WU Rui，BAO Jian-qiang*

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

ABSTRACTChinese soft-shelled turtle oil was extracted from its fat by enzymatic hydrolysis. The optimal conditions were as follows：enzymolysis temperature was 61℃, compound protease dosage was 1.25 %, material-water ratio was 1∶1.5, enzymolysis time was 2.5 h and the extraction rate was 76.3 %. The crude oil was refined through four steps including degumming, deacidification, decoloration and deodorization. The physical and chemical properties and fatty acid compositions of refined oil were analyzed. All of physical and chemical properties were accorded with national standard for refined fish oil at first grade. And thirty-three kinds of fatty acids in refined Chinese soft-shelled turtle oil were identified. The content of unsaturated fatty acids was 78.13 %.

Key wordsChinese soft-shelled turtle oil；refining；fatty acid

收稿日期：2015-09-22，改回日期：2015-11-11

基金项目：上海海洋大学水产动物遗传育种中心(ZF1206)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603032

第一作者：硕士研究生(包建强教授为通信作者，E-mail: baojq@shou.edu.cn)。