1株耐高温高盐生香酵母的选育及特性分析

谭才邓，王文文，朱美娟，廖延智，姚勇芳

(广东轻工职业技术学院，广东 广州, 510300)



1株耐高温高盐生香酵母的选育及特性分析

谭才邓，王文文，朱美娟，廖延智，姚勇芳*

(广东轻工职业技术学院，广东 广州, 510300)

摘要以豆瓣酱为材料筛选出86株产酯菌，以期从中得到1株耐高温高盐生香酵母菌。通过耐高温、耐高盐和产酯能力试验，获得1株耐高温高盐生香酵母菌PX-8，其在温度高达40 ℃和NaCl质量浓度高达180 g/L的条件下能正常生长。经过26S rDNA鉴定，确定菌株PX-8为鲁氏结合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)。经过产酯发酵条件优化试验，菌株PX-8的最佳产酯培养条件为：葡萄糖80 g/L，酵母粉40 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4 0.5 g/L，pH 6.0，32 ℃，150 r/min，发酵培养6 d，总酯产量高达2.615 g/L；在高温高盐条件下(发酵培养温度为40 ℃，盐质量浓度为180 g/L)，发酵培养21 d，总酯产量可达1.518 g/L。

关键词耐高温；耐盐；酵母；产酯

耐盐生香酵母主要应用于酱油的生产，由于其能够生产酯类、醇类等风味物质，故对酱油的品质有很大的影响。目前低盐固态酱油占我国酱油生产总量的70%以上[1]，低盐固态发酵的特点主要是生产周期短、工艺成熟、投资规模要求较小等，但缺点是由于发酵温度较高，发酵过程中除米曲霉外的有益微生物含量较低，使得酱油的色香味较差[1-3]。在已有的报道中，用于酱油生产的耐盐产酯酵母主要有：鲁氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、蒙奇球拟酵母(Torulopsismogii)、埃契氏球拟酵母(Torulopsisetchellsii)、易变球拟酵母(Torulopsisutilis)等[4-5]，它们在发酵过程中产生的风味物质有酯类、醇类、醛类、酚类、有机酸、糠醛类、呋喃酮类等[4-6]。另有研究表明，鲁氏酵母的谷氨酰胺酶还能转化底物生成谷氨酸从而增强酱油的鲜味[7]。

目前关于耐盐酵母种质资源的报道较多，如闫美[8]在辣椒酱中筛选出了1株耐盐性达240 g/L的鲁氏酵母，王春玲等[9]通过原生质体融合的方法筛选出一株耐盐性高于180 g/L的酿酒酵母，都有效提高了乙酸乙酯、乳酸乙酯等风味物质的含量，但关于耐高温高盐酵母的研究鲜见报道。在低盐固态酱油的生产过程中，有高温的发酵阶段，因而一般添加生香酵母只能在后发酵阶段，这样会导致酵母发酵时间不够长，酱油的整体品质提不上来。本试验旨在筛选出一株耐高温高盐的生香酵母，为酱油的低盐固态发酵生产提供种质资源参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1筛选材料

四川郫县豆瓣酱，市售。

1.1.2培养基

富集培养基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，NaCl 180 g/L，氯霉素0.1 g/L，pH6.0。

产酯筛选培养基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L，氯霉素0.1 g/L，溴甲酚紫0.05 g/L，吐温-80 5 mL /L，三乙酸甘油酯30 mL/L(灭菌后加入)，pH 7.2。

YPD(平板、斜面)培养基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，氯霉素0.1 g/L，琼脂粉20 g/L，pH6.0。

基础发酵培养基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 6.0。

1.2方法

1.2.1菌株富集培养与分离筛选

称取10 g左右的样品，接入200 mL富集培养基，40 ℃静置培养7 d。在无菌条件下，对富集液进行梯度稀释，涂布产酯筛选培养基，封口膜封口，40 ℃培养3～7 d至长出单菌落。从平板上挑取菌落附近有黄色圈的单菌落接入斜面培养基，30 ℃培养至长出菌苔，放入4 ℃冰箱保藏。

1.2.2菌株耐高温筛选

将筛选获得的菌株接种于50 mL基础发酵培养基，30 ℃、150 r/min的条件下振荡培养24 h制成种子液，然后以1%的接种量分别接种于100 mL新鲜发酵培养基，于40℃、150 r/min振荡培养3 d，观察菌体生长情况，取样并于600 nm处测定吸光度。

1.2.3菌株耐高盐筛选

按方法1.2.2制成种子液，以1%的接种量分别接种于100 mL含NaCl 180 g/L的发酵培养基，40℃、150 r/min的条件下振荡培养5 d，观察菌体生长情况，取样并于600 nm处测定吸光度。

1.2.4菌株产酯能力试验

按方法1.2.2制成种子液，以10%的接种量分别接种于100 mL发酵培养基(葡萄糖含量为80 g/L)，30 ℃、150 r/min的条件下振荡培养7 d，每隔1 d分别取样测定各菌株发酵液的总酯。

1.2.5总酯的测定[10-11]

量取50 mL发酵液，加入200 mL的蒸馏水，100 ℃进行蒸馏，收集馏出液50 mL，用回流皂化法测定馏出液中的总酯(以乙酸乙酯计)。

1.2.6菌株26S rDNA鉴定[12-13]

离心收集菌体，用酵母基因组DNA抽提试剂盒提取总DNA，作为PCR反应模板。PCR反应体系：5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol each) 5 μL，Primer-F(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3') 1 μL，Primer-R(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3') 1 μL，DNA模板1 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μL) 0.5 μL，补水至50 μL。PCR反应程序：96 ℃预变性4 min；96 ℃变性20 s，55 ℃退火15 s，72℃延伸1 min，32个循环；72℃延伸5 min，并用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况。PCR产物送华大基因科技有限公司进行测序。获得序列结果后，在NCBI网站进行序列比对，挑选与之同源性在95%以上的菌株的26S rDNA序列，利用Mega 6.0软件以Neighbor-Joining法进行1 000次步长计算构建系统发育树。

1.2.7目标菌株产酯发酵条件优化

按方法1.2.4，探讨碳源、氮源、温度、NaCl含量对菌株产酯的影响，具体种类及用量范围见表1。

表1　目标菌株产酯发酵条件优化因素表

注：摇瓶为1000 mL三角瓶装200 mL培养基，种子液接种量为10%，摇床转速为150 r/min，振荡培养6 d。

2结果与分析

2.1菌株分离纯化

经过富集培养和分离纯化，共获得86个带黄色圈的单菌落，选取10个黄色圈较大的单菌落划线至YPD平板，观察菌落形态并进行镜检，结果见表2。

表2　菌落与菌体特征

如表2所示，菌株PX-1、PX-2、PX-6、PX-7、PX-9的菌落形态均为圆形、乳白色、表面光滑，细胞形态为椭圆形，两端出芽繁殖；菌株PX-3、PX-4、PX-5、PX-8、PX-10的菌落形态均为圆形、乳白色、表面干燥，细胞形态为圆形，一端出芽繁殖。

2.2菌株耐高温、耐高盐实验

对获得的10株菌进行耐高温耐高盐实验，温度选择40℃，NaCl含量为180 g/L，结果见图1。

图1　菌株耐高温、耐高盐实验结果Fig.1　The test results of thermotolerant and salt-tolerance of target strains

从图1可知，在耐高温实验中，菌株PX-8长势最好，在600 nm处的吸光度为2.860，其次为菌株PX-3和PX-5，其吸光度分别为2.685和2.610，其余菌株的吸光度均小于2.600；在耐高盐实验中，菌株PX-10长势最好，吸光度达2.930，其次为菌株PX-8，其吸光度为2.910，其余菌株的吸光度均小于2.600。综合分析，菌株PX-8在耐高温耐高盐实验中，综合性能表现最优，而菌株PX-10虽然在耐高温实验中长势表现一般(吸光度为2.586)，但其在耐高盐实验中长势最好，故考虑选择菌株PX-8和PX-10进行下一步实验。

2.3菌株产酯能力实验

为了探讨筛选获得的两株耐高温高盐菌株PX-8和PX-10的产酯能力，对其进行了发酵产酯能力实验，其中发酵培养基的葡萄糖含量提高到80 g/L，结果见图2。

图2　菌株PX-8和PX-10产酯能力实验结果Fig.2　Yield of total ester produced from strain PX-8 and PX-10(培养条件为30℃、150 r/min振荡培养7 d)

由图2可知，菌株PX-8和PX-10在发酵1天后都明显产酯，而且总酯产量随发酵时间的延长而提高，到第6天达到最高值，分别为2.353 g/L和2.112 g/L。两株菌相比较，相同的发酵时间下PX-8比PX-10总酯产量高，在最高产量处高出11.4%左右。因此，在后续研究中，应选择菌株PX-8进行实验。

2.4菌种鉴定

用酵母基因组DNA抽提试剂盒提取目标菌株PX-8的总DNA，用设计合成的通用引物和高保真DNA聚合酶进行PCR扩增26S rDNA D1/D2区序列，产物经琼脂糖电泳检测，获得特异扩增目的片段，其大小约600 bp，与预计片段大小吻合。PCR产物送华大基因科技有限公司进行测序，序列长度为576 bp。在NCBI网站进行序列比对，结果显示，前100个相似性高的菌株中有78个为Z.rouxii，挑选与之同源性在95%以上的菌株的26S rDNA序列，利用Mega 6.0软件以Neighbor-Joining法构建系统发育分析图，如图3所示。

图3　菌株PX-8基于26S rDNA序列的系统发育分析图Fig.3　Phylogenetic analysis of strain PX-8 according to 26S rDNA sequence

由图3可看出，在系统发育分析图上，菌株PX-8与鲁氏结合酵母(Z.rouxiiY12)同源性可信度为100%，可认定PX-8为鲁氏结合酵母的一种。

2.5菌株PX-8产酯发酵条件优化

2.5.1碳源对菌株产酯量的影响

实验使用的碳源有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖，为了探讨其对菌株PX-8产酯量的影响，使用不同浓度的碳源配合基础发酵培养基进行研究，结果见图4。

图4　碳源对菌株PX-8产酯量的影响Fig.4　Effect of carbon sources on ester yield of strain PX-8(培养条件为30℃、150 r/min振荡培养6 d)

从图4可知，4种糖类当中，在相同浓度下，葡萄糖对菌株PX-8产酯贡献量最大，蔗糖最小，可认为葡萄糖更容易被菌株利用转化产生酯类物质，其用量在80 g/L时总酯产量最高，达到2.353 g/L，可见葡萄糖为最适合的碳源，应选择其作为碳源进行下一步实验，其使用质量浓度应为80 g/L。

2.5.2氮源对菌株产酯量的影响

本实验使用的氮源分为有机态氮(酵母粉、蛋白胨)和无机态氮(尿素、硝酸铵)两大类，为了探讨其对菌株PX-8产酯量的影响，使用不同含量的氮源配合葡萄糖(用量为80 g/L)进行研究，结果见图5。

图5　氮源对菌株PX-8产酯量的影响Fig.5　Effect of nitrogen sources on ester yield of strain PX-8(培养条件为30℃、150 r/min振荡培养6 d)

由图5可知，有机态氮更有利于菌株生产酯类物质，可能是有机态氮源在被菌体利用的过程当中，除了提供氮源之外，还为菌体提供某些因子，能促进酯化反应朝合成酯类物质的方向进行，从而提高总酯产量。4种氮源当中，在相同浓度下，酵母粉对菌株PX-8产酯贡献量最大，硝酸铵最小，可认为酵母粉更容易被菌株利用转化产生酯类物质，其用量在40 g/L时总酯产量最高，达到2.528 g/L，可见酵母粉为最适合的氮源，应选择其作为氮源进行下一步实验，其使用质量浓度应为40 g/L。

2.5.3培养温度对菌株产酯量的影响

为了探讨培养温度对菌株PX-8产酯量的影响，在最佳碳源和氮源的发酵培养基配比下，本实验温度范围选择在26～44℃之间，总酯产量结果如图6。

图6　培养温度对菌株PX-8产酯量的影响Fig.6　Effect of culture temperature on ester yield of strain PX-8(发酵培养基中葡萄糖80 g/L，酵母粉40 g/L，150 r/min振荡培养6 d)

由图6可知，培养温度低于32 ℃时，总酯产量随着培养温度的升高而增加；在培养温度高于32 ℃时，总酯产量随着培养温度的升高而减少。培养温度在30～34 ℃时菌株PX-8产酯量较高，在32 ℃时达到最高，总酯含量达2.615 g/L。当培养温度超过40 ℃时，总酯产量大幅度下降，由40 ℃时的1.596 g/L下降到44 ℃时的0.168 g/L，可能是温度过高，菌体生长与代谢过慢的缘故而严重降低了总酯的产量。

2.5.4盐质量浓度对菌株产酯量的影响

菌株PX-8在不同盐质量浓度下总酯产量如图7所示，随着培养基中NaCl质量浓度的增大，总酯产量呈不断下降趋势。其中，NaCl质量浓度在0～75 g/L，总酯产量由2.612 g/L逐渐下降至1.850 g/L，降幅较小，总酯产量总体也较高；当NaCl质量浓度在75～200 g/L时，总酯产量由1.850 g/L迅速下降至0.105 g/L，降幅较大，总酯产量总体也较低。可见，低NaCl质量浓度(0～75 g/L)较适合菌株PX-8产酯。

图7　盐浓度对菌株PX-8产酯量的影响Fig.7　Effect of salinity on ester yield of strain PX-8(发酵培养基中葡萄糖80 g/L，酵母粉40 g/L，32 ℃，150 r/min振荡培养6 d)

2.6菌株PX-8高温高盐条件下产酯能力测试

为了探讨菌株PX-8在高温高盐条件下的产酯能力，本实验在最佳碳源和氮源配比下延长发酵培养时间，考察了盐浓度在180 g/L、温度在40与42 ℃的条件下菌株产酯情况，总酯产量结果见图8。

图8　菌株PX-8在高温高盐条件下产酯结果Fig.8　Yield of total ester produced from strain PX-8 under high temperature and high salt conditions

从图8可知，在高温高盐条件下，随着发酵培养时间的延长，总酯产量呈上升趋势，在第21天时达到最高值，之后呈下降趋势。40 ℃培养与42 ℃培养相比，相同的培养时间内，40 ℃的总酯产量大大高于42 ℃，两者的最高值分别为1.518 g/L和0.695 g/L，前者为后者的218%。可见菌株PX-8在用于酱油的后发酵时，为提高总酯产量，温度不应高于40 ℃。

3结论

以豆瓣酱为筛选材料，通过富集、分离纯化、耐高温、耐高盐、发酵产酯能力的试验，选出1株耐高温高盐生香酵母菌PX-8，其在温度高达40 ℃和NaCl质量浓度高达180 g/L的条件下能正常生长，经过26S rDNA鉴定，基本确定其为鲁氏结合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)。经过培养基碳源、氮源、培养温度、NaCl浓度等因子的试验，确定菌株PX-8最佳产酯培养条件为：葡萄糖80 g/L，酵母粉40 g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5 g/L，pH 6.0，32 ℃，150 r/min，发酵培养6 d，总酯产量最高达到2.615 g/L；在高温高盐条件下(发酵培养温度为40 ℃，盐质量浓度为180 g/L)，发酵培养21 d，总酯产量可达1.518 g/L。

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Screening and characterization of aroma yeast with thermo-tolerant and salt-tolerance

TAN Cai-deng, WANG Wen-wen, ZHU Mei-juan, LIAO Yan-zhi, YAO Yong-fang*

(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300,China)

ABSTRACTTo obtain an aroma yeast strain with thermo-tolerance and salt-tolerance, 86 strains was isolated from bean paste. Through thermo-tolerance test, salt-tolerance test and determination of yield of este, strain PX-8 was screened out because it could grow normally at temperature up to 40 ℃ and NaCl concentration up to 180 g/L. According to 26S rDNA sequence analysis, strain PX-8 was identified as Zygosaccharomyces rouxii. The optimum conditions for production of ester with strain PX-8 were fermentation in medium cotaining glucose 80 g/L, yeast extract 40 g/L, KH2PO4 1 g/L, MgSO4 0.5 g/L, at pH6.0, 32 ℃, with 150 r/min shaking for 6 days. The yield of total ester was up to 2.615 g/L. After fermentation under high temperature and high salt conditions (fermentation temperature was 40 ℃, NaCl concentration was 180 g/L) for 21 days, the yield of total ester could reach 1.518 g/L. This study could provide useful reference for germplasm resources in the flavor promotion of fermented food such as soy sauce.

Key wordsthermotolerant; salt-tolerance; yeast; ester producing

收稿日期：2015-09-30，改回日期：2016-01-12

基金项目：广州市科技计划项目(201510010113)；创新强校工程专项资金项目(1A20205)。

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603016

第一作者：硕士，高级实验师(姚勇芳教授为通讯作者,E-mail:2002102016@gdite.edu.cn)。