Gankyrin蛋白在喉鳞癌中表达的实验研究

赵孝通， 张 园， 刘方舟， 李培华

临床与基础研究

Gankyrin蛋白在喉鳞癌中表达的实验研究

赵孝通， 张 园， 刘方舟， 李培华

目的 研究Gankyrin蛋白在喉鳞癌组织及喉鳞癌Hep-2细胞系中的表达。方法 免疫组织化学方法检测24例喉鳞癌组织、相应癌旁组织及10例正常组织，免疫细胞化学法检测Hep-2细胞系中Gankyrin蛋白的表达与分布，并计算阳性细胞率，进行统计分析。结果 喉鳞癌组织及Hep-2细胞系中，Gankyrin蛋白主要表达于细胞核。喉鳞癌组织中Gankyrin蛋白表达阳性细胞率(58.5%)明显高于相应癌旁组织(11.4%)及正常组织(18.1%)，且差异有统计学意义(均P<0.01)。结论 喉鳞癌组织及喉鳞癌Hep-2细胞系中均有Gankyrin蛋白的表达，可为Gankyrin在喉鳞癌中表达的后续相关研究提供理论依据。

喉鳞状细胞癌; 免疫组织化学; Gankyrin； 肿瘤标记物

喉鳞癌是头颈部常见的恶性肿瘤，其发生发展受体内多种基因及蛋白影响。Gankyrin蛋白又名p28GANK，是近年发现的癌蛋白。2000年， HIGASHITSUJI等人[1]在人肝癌组织cDNA文库中发现了Gankyrin基因，并通过对比肝癌组织与正常组织，首次提出Gankyrin mRNA在肝癌组织中高表达，拉开了人们对Gankyrin研究的序幕。现有关Gankyrin的研究多集中于消化系统肿瘤，本研究应用免疫组织化学方法对Gankyrin蛋白在喉鳞癌组织与喉鳞癌Hep-2细胞系中的表达进行定位，旨在为进一步研究Gankyrin蛋白表达与喉鳞癌间的关系做基础研究，并为后续临床诊疗研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 24例喉鳞癌组织及相应癌旁组织(肿瘤周边≤2 cm内的组织)、10例正常组织(肿瘤周边>2 cm外的组织)均取自2013年7月至2014年7月期间在江苏省肿瘤医院头颈外科住院手术患者，全为男性,24例，年龄50～82岁，中位年龄63岁。标本常规多聚甲醛固定石蜡包埋，用于免疫组织化学检测。所选患者术前均未施行放疗、化疗，术后肿瘤组织经病理科两位副主任医师病理确诊。

1.1.2 细胞系 喉鳞癌Hep-2细胞系由南京市鼓楼医院沈晓辉副主任医师惠赠。

1.1.3 主要试剂与仪器 兔抗人 Gankyrin单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司(BIOSS，稀释比例1∶100)，通用型SP免疫组织化学试剂盒和DAB显色试剂盒购自福州市迈新生物技术开发公司，10%胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，不完全DMEM(高糖)培养基购自GIBCO，CO2培养箱(HERA cell 150)购自Thermo，倒置荧光显微镜(Axiovert 200)(ZEISS)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 喉鳞癌Hep-2细胞系在含10%的胎牛血清的DMEM培养基(含青霉素80 U/ml；链霉素0.08 mg/ml；L-谷氨酰胺和碳酸钠)中生长，于37 ℃，5%CO2的培养箱培养，细胞密度达80%后传代。

1.2.2 喉鳞癌组织的免疫组织化学检测 实验采用常规免疫组织化学方法SP法。组织标本经多聚甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，常规脱蜡，梯度酒精脱水；于枸橼酸缓冲液(pH=6.0)中行微波抗原修复；滴加过氧化氢，室温孵化；滴加BSA封闭液，37 ℃加热20 min；滴加兔抗人Gankyrin单抗(1∶100)，4℃过夜， PBS代替一抗作阴性对照；次日，滴加生物素标记二抗，置37 ℃加热30 min；滴加标记链霉素卵白素工作液，置37 ℃加热30 min；DAB显色，苏木精染色，封片。

1.2.3 喉鳞癌Hep-2细胞系的免疫细胞化学检测 Hep-2细胞系经常规消化离心后，取细胞悬液滴至灭菌的盖玻片，滴加DMEM培养液，37 ℃、5%CO2培养箱中行细胞爬片24 h；PBS清洗，滴加丙酮固定15 min。细胞爬片制作完成后，余下步骤同SP法免疫组化。

1.3 结果观察

喉鳞癌组织和喉鳞癌Hep-2细胞系中的Gankyrin蛋白经染色后呈棕黄色颗粒，于荧光显微镜下选取多个×10视野观察，以已知Gankyrin蛋白阳性表达的肝癌组织作阳性对照，肿瘤细胞的细胞核(少量胞质)中表达为阳性细胞。将组织切片(细胞爬片)置于镜下，随机选取10个不重复视野，各计100个细胞中Gankyrin蛋白阳性细胞数，取均值后算得阳性细胞所占比例，即阳性细胞率=阳性细胞数平均值/100×100%。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 Gankyrin蛋白在喉鳞癌组织中的表达

Gankyrin蛋白在喉鳞癌组织中的免疫组织化学结果显示，Gankyrin蛋白主要定位于喉鳞癌组织的细胞核内，呈棕黄色颗粒，深浅不一。此外，亦有少量肿瘤细胞胞质中见Gankyrin蛋白表达。喉鳞癌组织中Gankyrin蛋白表达水平较高，相应的癌旁组织中Gankyrin蛋白的表达水平较低(图1、图2)。喉癌组织与癌旁组织和正常组织间的阳性细胞率差异均有统计学意义(P<0.01，表1)。

图1 Gankyrin蛋白在喉鳞癌组织中的表达(SP法 ×200)

图2 Gankyrin蛋白在癌旁组织中的表达(SP法 ×200)

癌组织癌旁组织正常组织P阳性细胞百分率58.5±1.6711.4±1.42*18.1±1.81*<0.01

注：*癌组织组与癌旁组织组(t=89.230，P<0.01)、癌组织组与正常组织组(t=63.310，P<0.01)比较有统计学意义。

2.2 Gankyrin蛋白在喉鳞癌细胞系Hep-2中的表达

Hep-2细胞中Gankyrin蛋白的阳性染色定位及阳性细胞率与其在喉鳞癌组织中的检测结果基本相符。通过显色，Gankyrin蛋白阳性染色除主要定位在喉鳞癌Hep-2细胞系的细胞核, 部分细胞质同时为阳性染色，阳性细胞百分率为62.4%(图3)。

图3 Gankyrin蛋白在喉鳞癌细胞系Hep-2中的表达(SP法 ×200)

3 讨论

Gankyrin蛋白是一种在空间结构上高度保守的小分子蛋白，其通过与不同蛋白质的结合，调控细胞的增值并产生相应的细胞生命活动[2]。研究表明，Gankyrin蛋白的致瘤性与Rb密切相关，Gankyrin蛋白可竞争性抑制p16与CDK4结合，从而释放CDK4的活性，促进Rb的磷酸化，增强细胞的增殖[3]；Gankyrin蛋白的高表达还能提高癌基因MDM2/HDM2的活性，进而促进MDM2对p53泛素化降解，促使细胞过度增殖及肿瘤细胞的形成[4];此外，与RelA直接结合后，Gankyrin蛋白可在转录水平通过SIRT1调控乙酰化，抑制NF-κB通路的激活，下调NF-κB的促凋亡作用[5]。MAN等[6]指出，Gankyrin蛋白能够促进RhoA与RhoGDI(Rho-GDP的解离抑制子)结合，抑制RhoA活性，影响PI3K-AKT通路的激活。综上所述，Gankyrin蛋白通过多种途径使正常细胞趋向恶化，参与肿瘤的形成过程。

Gankyrin蛋白高表达最早发现于肝癌组织中[1]。Gankyrin蛋白的表达与肿瘤的肝内转移与包膜侵犯密切相关，其表达程度会随着肝癌的发展逐渐增高。此外，Gankyrin蛋白的测定具有一定的预后判断参考价值，在Gankyrin高表达的同时，提示了肝癌术后患者的低生存率及高复发率[7]。近年，Gankyrin蛋白的高表达不仅在肝癌、食管鳞癌[8]、结肠癌[9]等消化系统肿瘤中发现,而且在乳腺癌[10]、子宫内膜癌[11]等消化系统以外的肿瘤组织中的表达也逐渐引起国内外学者的关注，但目前尚未见Gankyrin蛋白在喉鳞癌中表达的相关研究的报道。LI等[12]的研究发现，在口腔鳞癌中，Gankyrin蛋白的阳性表达在早期即可出现。研究者通过Western-blot和免疫组化的方法，在翻译水平检测多种口腔鳞癌组织及细胞系中Gankyrin基因的表达情况，指出Gankyrin基因的异常表达在口腔鳞癌中普遍存在，Gankyrin基因和蛋白表达水平检测有助于临床判断口腔鳞癌的分化程度及发展阶段。这提示，Gankyrin蛋白在与口腔鳞癌相似且关系密切的喉鳞癌组织中也存在高表达的可能，并且具有一定的研究价值与实际临床意义。本实验首次运用免疫组织化学及免疫细胞化学的方法,分别对喉鳞癌组织和喉鳞癌Hep-2细胞系中Gankyrin蛋白的表达情况进行检测，结果显示，Gankyrin蛋白在喉鳞癌组织中主要表达于细胞核,少量表达于胞质。喉鳞癌组织中Gankyrin蛋白的阳性细胞率(58.5%)明显高于相应癌旁组织(11.4%)及正常组织(18.1%)(均P<0.01)。喉鳞癌Hep-2细胞系中的实验结果进一步验证，在细胞水平上Gankyrin蛋白同样存在很高的表达率(62.4%)，蛋白的表达与定位也与喉鳞癌组织基本相符。Gankyrin蛋白在喉鳞癌组织中的高表达，提示Gankyrin蛋白可能与喉鳞癌的发生有关，虽然具体机制有待研究，但为揭示Gankyrin蛋白表达与喉鳞癌间关系的后续研究提供了参考依据。

初期，人们通过分析肝癌组织中Gankyrin的表达情况与临床病理参数间的关系，探索将Gankyrin的基础研究应用于临床工作的可能性。如今，研究者们发现[13]，Gankyrin蛋白的高表达与多种肿瘤细胞的发生发展、临床表现以及预后情况密切相关，并有人尝试将Gankyrin作为新的肿瘤标志物运用于临床，Gankyrin也有望成为新的肿瘤基因治疗靶点。喉鳞癌的早期发现与治疗能明显提高患者的生存率和治愈率，Gankyrin蛋白在喉鳞癌中的高表达提示了其可能在喉癌发生发展中扮演重要角色。通过单独检测Gankyrin的表达情况或与其他已知喉癌相关基因联合检测，或许可为喉鳞癌的早期诊断、早期干预及预后判断提供参考。Gankyrin和喉鳞癌病理及临床分期间的关系是我们进一步研究的方向。

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The experimental study of the expression of Gankyrin proteins in laryngeal carcinoma tissues and cell lines Hep-2

ZHAOXiaotong1,ZHANGYuan2,LIUFangzhou2,LIPeihua3.

(1.GraduateSchool,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou221000,China; 2.DepartmentofHeadandNeckSurgery,JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China;3.DepartmentofOtolaryngology,HospitalAffiliatedtoXuzhouMedicalCollege，Xuzhou221000,China)

Corresponding author:LIPeihua,E-mail：Lipeihua000@126.com

Objective To investigate the expression of Gankyrin proteins in laryngeal carcinoma tissues and cell lines Hep-2. Methods The expression of Gankyrin proteins in laryngeal carcinoma tissues ，para- carcinoma tissues(n=24)and normal tissues(n=10)were assessed by immunohistochemical technique，and in cell lines Hep-2 by immunocytochemistry technique.The positive cells were counted and located under the microscope. Results The Gankyrin proteins expressed mainly in the cell nucleus. The expression of Gankyrin protein in laryngeal carcinoma(58.5%) is significantly higher than in para-cacinoma tissues(11.4%) and normal tissues(18.1%),and the difference was statistically significant(P<0.01). Conclusions Gankyrin proteins expressed both in laryngeal carcinoma tissues and Hep-2 cell lines, which give the basic function for the study of Gankyrin in laryngeal carcinoma.

Laryngeal cell carcinoma; Immunohistochemistry; Gankyrin； Tumor marker

221000 江苏 徐州，徐州医学院研究生学院(赵孝通)；210009 江苏 南京，江苏省肿瘤医院

头颈外科(张 园，刘方舟)；221000 江苏 徐州，徐州医学院附属医院 耳鼻喉科(李培华)

赵孝通，男，在读硕士研究生，研究方向：喉癌的基础与临床研究，E-mail：sszsxkdb@sina.com

李培华，男，主任医师，硕导，研究方向：头颈部肿瘤的基础与临床研究，E-mail：Lipeihua000@126.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2016.01.008

1674-4136(2016)01-0026-04

2015-10-13][本文编辑：文 心]