爆炸致兔急性肺损伤时细胞凋亡作用机制的研究

齐晓林,吴　升,马宏昊,黄奕江,叶长青,郝　建,贺慧博,李树雯,李成恩,黄　鑫



·基础医学·

爆炸致兔急性肺损伤时细胞凋亡作用机制的研究

齐晓林1,吴升2,马宏昊3,黄奕江1,叶长青1,郝建2,贺慧博2,李树雯2,李成恩2,黄鑫2

[摘要]目的：探讨细胞凋亡在爆炸致兔急性肺损伤(ALI)中的作用机制。方法：选取兔40只，随机分为空白对照组10只；实验组30只，空气爆炸损伤胸部，制作ALI模型，分别于爆炸损伤4、12、24 h后采样(每时间点各10只)，测定肺干/湿重比、动脉血氧分压，原位末端标记检测肺组织细胞凋亡情况，免疫组织化学法检测Caspase-3、Bax、Bcl-2含量。选取肺组织，显微镜观察光镜下肺组织病理形态。结果：光镜下，实验组4 h起可见肺间质、肺泡明显水肿，肺泡腔大量红细胞、炎性细胞及浆液性渗出，肺间质增厚。与对照组比较，各实验组肺干/湿重比均明显升高(P<0.01)，动脉血氧分压均明显降低(P<0.01)。凋亡指数均明显升高(P<0.01)，Caspase-3与Bax/Bcl-2比值均较对照组升高(P<0.05～P<0.01)。结论：细胞凋亡在兔ALI的发生、发展过程中起重要作用，参与了肺组织损伤，促进ALI病情进展。

[关键词]肺损伤；细胞凋亡；爆炸伤；血气分析；兔

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)指机体遭受直接、间接损伤导致肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞受损，进而引起呼吸功能障碍的复杂病理过程。ALI治疗不理想时，可发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，国内每年ALI/ARDS病例20余万例，其中爆炸伤致ALI/ARDS病例占据一定的比例。ALI发病机制比较复杂，死亡率高，对其作用机制的研究，可为临床诊治提供依据。研究[1]显示凋亡机制参与了ALI的发病过程，ALI患者肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞凋亡增加，细胞数量减少，促进病情进展。本研究旨在通过检测ALI兔模型血浆Caspase-3、Bax、Bcl-2含量，探讨细胞凋亡在ALI中的作用机制。

1材料与方法

1.1材料实验动物：40只健康新西兰兔,雌雄各半，体质量(2.23±0.28)kg，由安徽长临河医药科技有限公司提供，许可证号scxk(皖)2006-002。试剂与仪器：原位末端标记(TUNEL)使用Roche公司试剂盒，货号11684817910，批号10279600；DAB显色剂使用北京中杉公司产品，货号ZLI-9018，批号K136821F。免疫组织化学试剂盒使用 Santa Cruz公司产品，Bax试剂盒货号sc-493，批号G7514；Bcl-2试剂盒货号SC-492，批号H5860；Caspase-3试剂盒货号SC-7148，批号G2545。血气分析仪使用美国OPTI公司CCA-TS型血气分析仪。

1.2实验方法

1.2.1实验分组将40只新西兰兔随机分为空白对照组(A组)(n=10)、实验组(n=30)；实验组再根据爆炸损伤后采样时间随机分为B组(4 h)、C组(12 h)和D组(24 h)，每时间点各10只。

1.2.2模型建立使用中国科学技术大学研制的爆炸装置，并按照爆炸力学相关公式及肺组织病理观察结果设定合理爆炸剂量、距离。将兔固定于实验装置平台上，暴露前胸及侧胸壁，其余部位由自行设计的保护装置进行防护。观察呼吸频率、心率，测血氧分压及肺干/湿重比(W/D)，观察肺组织病理形态学，建立爆炸致兔ALI模型。模型建立标准：动脉血氧合指数(PaO2/FiO2)≤300 mmHg，测定W/D，观察肺组织病理形态学，判断肺损伤、肺水肿程度。

1.2.3标本采集水合氯醛(0.35 g/kg)耳缘静脉麻醉实验兔，采集颈外动脉血行血气分析，颈内静脉血4 ℃离心备用，同时处死实验兔。结扎右侧肺门，0.9%氯化钠注射液10 mL反复3次灌洗左肺，灌洗液离心备用。取右肺中叶，吸干表面杂质，测W/D。右肺下叶经0.9%氯化钠注射液冲洗，10%甲醛固定。其余右肺叶迅速置于液氮中保存。

1.3观察指标(1)肺组织病理组织学观察：取右肺下叶组织10%甲醛固定，石蜡包埋，切片4～5 μm厚，HE染色，光镜下观察。(2)W/D：取右肺中叶，吸干表面杂质，天平称取肺湿重后，置于80 ℃烘箱烘72 h至烘干，称取干重，计算W/D。(3)动脉血气分析：消毒颈外动脉，采动脉血2 mL，即刻行血气分析。(4)肺组织细胞凋亡检测：采用TUNEL法检测，按试剂盒操作流程操作；DAB显色，细胞核呈棕黄色为阳性；光学显微镜计数、分析。(5)肺组织Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达检测：采用常规SABC法，按试剂盒推荐方法进行操作；DAB显色，胞质染色呈棕黄色为蛋白表达阳性；采用灰度值计数相对含量。

1.4统计学方法采用方差分析和q检验。

2结果

2.1肺组织病理组织学观察肉眼可见双侧肺体积增大、实变，表面散在大小不等瘀斑，部分组织切面可见红色实样变，泡沫样渗出。光镜下可见肺泡间隔增大，肺泡腔相对狭窄，正常肺泡结构被破坏，肺泡腔、肺间质水肿、渗出,部分可见出血，并伴有炎症细胞浸润(见图1)。

2.24组兔W/D、 PaO2和组织细胞凋亡指数比较B、C和D组W/D和细胞凋亡指数均较A组明显增加(P<0.01)，而PaO2均显著低于A组(P<0.01)； D组和C组细胞凋亡指数均明显高于B组(P<0.01)，而D组细胞凋亡指数则低于C组(P<0.05)(见表1)。

2.34组肺组织Caspase-3、Bax、Bcl-2表达及Bax/Bcl-2比较B、C和D组Caspase-3、Bax、Bcl-2表达及Bax/Bcl-2比值均较A组增高(P<0.05～P<0.01)，C组、D组Bax、Caspase-3和Bax/Bcl-2比值均高于B组(P<0.05～P<0.01)，而Bcl-2均低于B组(P<0.01和P<0.05)；D组Bax、Caspase-3和Bax/Bcl-2均低于C组(P<0.05～P<0.01)，而Bcl-2高于C组(P<0.05)(见表2)。

3讨论

本实验采用特殊防护装置保护动物气道，爆炸瞬间产生高能冲击波及大量气体，实验通过控制爆炸冲击波作为主要影响动物肺的损伤。动物肺部受到爆炸冲击波作用，肺内压力骤升，压迫肺组织，产生严重肺挫裂伤，致肺泡腔、肺间质出血、水肿、渗出，W/D增高，通气/血流比值失调；同时肺组织炎性渗出增多，细胞凋亡增加。本实验结果显示，与A组比较，实验组光镜下肺组织病理损伤明显，PaO2明显下降(P<0.01),W/D明显升高(P<0.01)，说明造模成功。在成功造模后，在伤后的不同时间点取材，检测Caspase-3、Bax、Bcl-2表达情况。结果发现，在伤后4 h时Caspase-3、Bax、Bcl-2已有明显改变，12 h时改变最明显，24 h后表达有所降低。

表1　4组兔肺组织W/D、PaO2值和细胞凋亡指数比较

q检验：与A组比较**P<0.01；与B组比较△△P<0.01；与C组比较#P<0.05

q检验：与A组比较*P<0.05,**P<0.01； 与B组比较△P<0.05,△△P<0.01； 与C组比较#P<0.05,##P<0.01

细胞凋亡是生物体为维持内环境稳定，由基因控制的自主程序性死亡。研究[1]表明，细胞凋亡参与ALI的过程，机制可能是：肺泡上皮细胞凋亡，数量减少，弥散功能下降，肺泡有效交换面积减少，影响通气/血流比值；肺毛细血管内皮细胞凋亡，血管壁通透性增加，炎性渗出增多，肺间质出血、水肿，压迫肺泡，引起肺泡腔狭窄，进一步影响通气/血流比值，导致低氧血症发生；支气管上皮细胞凋亡增加则可能加重呼吸困难[2]。本研究实验组早期病理切片即可见肺间隔增宽，肺泡腔狭窄，正常肺泡结构破坏，肺泡腔、肺间质严重水肿、渗出，并伴有炎性细胞浸润。TUNEL法染色显示，实验组早期即发生凋亡，故认为凋亡在早期即参与了ALI的发生、发展过程，这与国外学者[3]研究结果一致。

研究[4]显示，肺组织凋亡受Caspase、Bcl-2、Fas/FasL等家族的影响。诱导细胞凋亡实际上都是通过Caspase蛋白的次序激活实现的，其中Caspase-3参与了大多数的凋亡过程，是细胞凋亡效应剂，也是最为关键的执行因子，在凋亡级联激活中处于核心地位[5-6]。本实验结果提示，实验组损伤后肺组织Caspase-3 即有大量表达，且与肺细胞凋亡程度基本一致，结果与相关文献[7]报道一致。

研究[8]发现Bcl-2家族是Caspase-3的上游调控机制。Bcl-2家族的表达、调控在细胞凋亡的信号转导过程中发挥着重要角色。Bcl-2、Bax分别是Bcl-2家族中抑制凋亡、促凋亡最具代表性因子。目前研究[8]发现Bcl-2家族在受到信号刺激后，家族中相关促凋亡蛋白可发生构象改变，通过影响抑制凋亡/促凋亡蛋白平衡，最终影响凋亡进程。Bcl-2是体内重要的抗凋亡蛋白，其抗凋亡的机制主要是：(1)抑制凋亡蛋白酶Caspase，包括Caspase-3的激活；(2)直接抗氧化作用；(3)抑制具有促凋亡作用物质的释放；(4)抑制促凋亡蛋白Bax[9]。而Bax是Bcl-2家族最广泛的促凋亡蛋白[10]。目前认为Bax促凋亡的机制主要是：(1)影响细胞氧化还原作用；(2)改变线粒体膜渗透性，影响氧化磷酸化及ATP的合成；(3)激活Caspase信号转导途径，促进凋亡发生；(4)拮抗抗凋亡蛋白Bcl-2。大量研究[4，8-9]表明，Bax/Bcl-2的比值对细胞是否发生凋亡有重要意义。本实验研究结果表明，实验组Bax及Bax/Bcl-2比值变化与肺组织细胞凋亡情况基本一致。故认为爆炸损伤后激活兔肺组织凋亡程序，凋亡活性增强，抗凋亡活性受到抑制，从而诱导凋亡发生。

本实验结果还显示，实验组通过Caspase-3、Bax表达增加，Bcl-2表达减少，从而影响Bax/Bcl-2比值。因此，推断机体可能通过激活Caspase-3、Bax，抑制Bcl-2，从而促进凋亡发生。但本实验结果提示，实验D组凋亡细胞值较C组有所下降，伴随Caspase-3、Bax部分降低及Bcl-2部分升高。其机制可能是：(1)ALI晚期病变程度较重，中性粒细胞(尤其是多型核中性粒细胞，其存活时间长短可影响损伤程度)凋亡减少，可加重炎症损伤[11-12]；(2)在ALI疾病过程中，肺泡Ⅱ型细胞以凋亡的形式参与修复，而在ALI晚期，可见明显Bcl-2上调，肺泡Ⅱ型细胞凋亡减少，修复作用减弱，加重损伤[13]；(3)在ALI晚期，机体的自身调控作用导致抗凋亡作用表达有所增加。本实验结果显示，细胞凋亡在ALI时表现为先增加后减低的趋势，此前国内研究[14]也有相关报道。

鉴于本实验血浆Caspase-3、Bax、Bcl-2在ALI早期即有明显改变，且与损伤凋亡情况基本一致，因此，对于ALI，检测以上指标对早期诊断、干预具有很好的指导意义，可以有效协助临床进行肺损伤严重程度的评估。但ALI的病理机制十分复杂，影响因素较多，目前认识有限，因此凋亡致ALI的作用机制还需进一步研究。

[参考文献]

[1]MATUTE-BELLO G,MARTIN TR.Science review:apoptosis in acute lung injury[J].Critical Care,2003,7(5):355.

[2]PERL M,LOMASNEIRA J,VENET F,etal.Pathogenesis of indirect (secondary) acute lung injury[J].Expert Rev Respir Med,2011,5(1):115.

[3]KUN-YOUNG K,JAE-HWI J,SUN-YOUNG K,etal.Cadmium induced acute lung injury and TUNEL expression of apoptosis in respiratory cells.[J].J Korean Med Sci,2003,18(5):655.

[4]余欢明,冯文明,王耀.δ阿片受体激动剂对脓毒症大鼠肺组织细胞凋亡及肺组织Bcl-2、Caspase-3表达的影响[J].中国中西医结合外科杂志,2010,16(5):561.

[5]MCILWAIN DR,BERGER T,MAK TW.Caspase functions in cell death and disease[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2013,5(4):a008656.

[6]DAMARLA M,PARNIANI AR,JOHNSTON L,etal.Mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2 mediates apoptosis during lung vascular permeability by regulating movement of cleaved caspase 3 [J].Am J Respir Cell Mol Biol,2013,50(5):932.

[7]CROSS LJ,MATTHAY MA.Biomarkers in acute lung injury:insights into the pathogenesis of acute lung injury[J].Crit Care Clin,2011,27(2):355.

[8]HARDWICK JM,SOANE L.Multiple functions of BCL-2 family proteins[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2013,5(2):a008722.

[9]LETAI A.Pharmacological manipulation of Bcl-2 family members to control cell death[J].J Clin Inves,2005,115(10):2648.

[10]FU H,WANG QS,LUO Q,etal.Simvastatin inhibits apoptosis of endothelial cells induced by sepsis through upregulating the expression of Bcl-2 and downregulating Bax[J].World J Emerg Med,2014,5(4):291.

[11]MA HJ，HUANG XL，LIU Y,etal.Sulfur dioxide attenuates LPS-induced acute lung injury via enhancing polymorphonuclear neutrophil apoptosis[J].Acta Pharmacol Sin,2012,33(8):983.

[12]肖敏,范红,文富强,等.巨噬细胞炎症蛋白-2和细胞凋亡在内毒素诱导急性肺损伤发病中的作用探讨[J].中国现代医学杂志,2007,17(11):1304.

[13]管弦,王导新.肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡在急性肺损伤中研究进展[J].临床肺科杂志,2012,17(6):1101.

[14]王颖,张淑文,王宝恩.细胞凋亡在大鼠急性肺损伤发生机制中的意义[J].中国危重病急救医学,2001,13(2):90.

(本文编辑姚仁斌)

The mechanism of cell apoptosis in rabbit with acute lung injury induced by blast

QI Xiao-lin1,WU Sheng2,MA Hong-hao3,HUANG Yi-jiang1,YE Chang-qing1,HAO Jian2,HE Hui-bo2,LI Shu-wen2,LI Cheng-en2,HUANG Xin2

(1.DepartmentofInternalMedicine,The123thHospitalofPLA,BengbuAnhui233010;2.HangzhouSanatoriumofPLA,HangzhouClinicalSchoolofAnhuiMedicalUniversityofPLA,DepartmentofCardiopulmonaryRehabilitationCenter,The128thHangzhouHospital,HangzhouZhejiang310007;3.DepartmentofModernMechanics,UniversityofScienceandTechnologyofChina,HefeiAnhui230026,China)

[Abstract]Objective:To investigate the mechanism of cells apoptosis in rabbit with acute lung injury(ALI) induced by blast.Methods:Forty rabbits were randomly divided into the control group(n=10) and experimental group(n=30).The ALI model of rabbit was established by air blast.After 4,12 and 24 hours of lung injury,the cells apoptosis of injury tissue were detected using the wet/dry weight ratio(W/D) of lung,PaO2 and TUNEL,the levels of caspase-3,Bax and Bcl-2 were detected using immunohistochemistry and the pathological morphology were observed under microscopy in 10 rabbits each time-point.Results:The pulmonary interstitial and alveolar edema，a large number of red blood cells,inflammatory cells and serous effusion in alveolar space,and pulmonary interstitial thickening were found in experimental group under light microscope.Compared with the control group,the W/D and PaO2 in experimental group increased and decreased significantly,respectively(P<0.01),The apoptosis index,caspase-3 and Bax/Bcl-2 in experimental group were significantly higher than those in control group(P<0.05 to P<0.01).Conclusions:Apoptosis plays an important role in the occurrence and development of ALI,which is involved in lung tissue injury and promoting the development of ALI.

[Key words]lung injury;apoptosis;burst injury;blood gas analysis;rabbit

[中图法分类号]R 563.9

[文献标志码]A

DOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.02.005

[作者简介]齐晓林(1971-)，男，硕士研究生，主任医师.[通信作者] 郝建，博士研究生导师,主任医师，教授.E-mail:jianhao105@163.com

[基金项目]南京军区医药卫生重点课题(14ZD41)

[收稿日期]2016-01-21

[文章编号]1000-2200(2016)02-0155-04

[作者单位] 1.解放军第一二三医院 内科，安徽 蚌埠 233010；2.南京军区杭州疗养院,安徽医科大学解放军杭州临床学院,杭州一二八医院 心肺康复医学中心，浙江 杭州 310007；3.中国科学技术大学 近代力学系,安徽 合肥 230026