HPLC测定连栀矾溶液中表小檗碱、黄连碱、巴马汀和盐酸小檗碱的含量

袁学刚，王战国，胡慧玲，杨向东，邹亮，余腾江，4，刘巧



HPLC测定连栀矾溶液中表小檗碱、黄连碱、巴马汀和盐酸小檗碱的含量

袁学刚1，王战国2，胡慧玲3，杨向东1，邹亮2，余腾江1，4，刘巧3

[摘要]目的：建立快速测定连栀矾溶液中表小檗碱、黄连碱、巴马汀和盐酸小檗碱含量的HPLC方法。方法：色谱柱为ChromstarTM C(18)色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流动相为乙腈-含0.1 ％三乙胺和0.1 ％甲酸的水溶液（30:70，V/ V）；检测波长345 nm，柱温30 ℃，流速0.8 mL．min(-1)。进样量20 μL。结果：连栀矾溶液样品中表小檗碱、黄连碱、巴马汀和盐酸小檗碱在12 min 内达到分离，峰形尖锐对称。盐酸小檗碱在 2.82～44.91 μg．mL(-1)范围内线性关系良好，平均加样回收率为97.95％。七批次连栀矾溶液中表小檗碱、黄连碱、巴马汀和盐酸小檗碱含量以盐酸小檗碱计，分别为0.126 ± 0.019，0.167 ± 0.029，0.140 ± 0.018和0.618 ± 0.079 mg．mL(-1)。结论：建立的HPLC方法高效、准确，经济，精密度好，灵敏度高，可用于连栀矾溶液中表小檗碱、黄连碱、巴马汀和盐酸小檗碱的同时快速测定分析。

[关键词]高效液相色谱；连栀矾溶液；表小檗碱；黄连碱；巴马汀；盐酸小檗碱

[作者单位]1.成都肛肠专科医院，四川 成都 610037；2.成都大学医学院（护理学院），四川 成都 610106；3.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137；4.泸州医学院附属中医院，四川 泸州 646000

“连栀矾溶液”出自我国著名中医肛肠病学专家黄济川先生的临床效验方，为成都肛肠专科医院的医院效验制剂（川药制字Z 20080191）。制剂由黄连、栀子、白矾等药组成，经古法工艺制备而成，常用于慢性溃疡性直肠炎[1-4]、肛漏[5]、肛门坠胀[6-7]、肛周脓肿[8-10]和肛门尖锐湿疣[11]等肛肠科疾病的临床治疗和预防，且疗效显著。鉴于该医院制剂的现有质量控制方法仅仅采用薄层色谱法开展黄连药材的定性控制，迫切需要开展定量质量控制分析研究，以保障医院制剂的质量。本文采用高效液相色谱法（HPLC）进行制剂中的盐酸小檗碱及相关成分的含量测定方法研究，研究结果可为连栀矾溶液质量控制提供参考。

1　仪器与试药

Agilent 1100 高效液相色谱仪（HPLC），包括4元泵系统、全自动脱气单元、VWD 检测器单元和Agilent 1100 色谱工作站等（Agilent Techologies，USA）；SB-300 DTY型数控超声仪（宁波新芝生物科技有限公司）；WSD-II型超纯水系统（成都威思达智能科技有限公司）。

盐酸小檗碱（98.14％，NO.0713-9906），购自中国药品食品检定研究院；乙腈、甲酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯。7批次连栀矾溶液（批号为：20120201，20121001，20121101，20130201，20131001，20131101，20131201）由成都肛肠专科医院提供。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱，ChromstarTMC18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相为乙腈-水（每1000mL含1mL三乙胺，1mL甲酸）为30:70（V/V）；检测波长为345 nm；流速：0.8 mL．min-1，柱温：30℃。

2.2对照品储备溶液的制备

取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定（5.72mg），置于50 mL棕色量瓶中，加入甲醇约45 mL，超声处理 15 min（100 Hz），室温放置10 min后用甲醇定容至刻度，得盐酸小檗碱对照品储备溶液（112.272 μg．mL-1）。

2.3供试品溶液的制备

将7批不同批号（YP1-YP7）的连栀矾溶液（n=3），分别精密量取连栀矾溶液0.5 mL，置入25mL棕色量瓶中，加入甲醇定容至25 mL，称定质量，超声处理15 min（100 Hz），放置冷却后，用甲醇补足重量，分别用1mL样品溶液过0.45µm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.4线性关系考察

精密量取对照品储备溶液4 mL，置 10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇约 4 mL，超声处理 5 min，混匀，冷却后，用甲醇定容至刻度，得1号对照品溶液（S1）；采用倍数稀释法，精密量取S1对照品溶液5 mL，置 10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇约 4 mL，超声处理 5 min，混匀，冷却后，用甲醇定容至刻度，得2号对照品溶液（S2）；精密量取S2对照品溶液5 mL，置 10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇约4 mL，超声处理 5 min，混匀，冷却后，用甲醇定容至刻度，得3号对照品溶液（S3）；按上法，依次获得S4～S5。S1-S5对照品溶液分别过 0.2 μm 微孔滤膜后，按上述色谱条件进样测定，记录色谱峰。以色谱峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归，得回归方程：Y＝88.243 X＋43.48，r＝0.9999；盐酸小檗碱在 2.82～44.91 μg．mL-1浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.5系统适应性考察

选择3号对照品溶液（S3），连栀矾溶液供试品溶液（样品4，生产批号：20130201），按上述色谱条件进样分析，记录其色谱图（图1）。盐酸小檗碱峰形尖锐对称，保留时间约为9.5 min，与其他色谱峰的分离度大于1.5，理论塔板数大于5000，拖尾因子符合分析要求，供试品溶液中其它物质不干扰盐酸小檗碱的测定。同时表小檗碱、黄连碱和巴马汀与盐酸小檗碱的相对色谱峰位置如图1所示，分别由峰2，3和4表示。

图1　供试品溶液（YP4-1）和对照品溶液(S3)的HPLC色谱图

2.6精密度试验

选择对照品溶液（S3），按上述色谱条件进样测定，分别连续进样 5 次，记录色谱图，记录盐酸小檗碱峰面积数据，其峰面积的RSD为3.23％，表明精密度良好。

2.7稳定性试验

取样品1溶液，在室温（21 ℃）条件下分别于0，4，8，16，24 h 按上述色谱条件进样测定，记录盐酸小檗碱峰面积数据，其峰面积的RSD为3.76 ％，表明供试品溶液在24 h内的稳定性较好。

2.8重现性试验

取样品1，按供试品溶液制备方法，平行制备供试品溶液5份，按上述色谱条件进样测定，记录色谱图，记录盐酸小檗碱的峰面积，计算得盐酸小檗碱的含量为0.735 ± 0.033 mg．mL-1，盐酸小檗碱含量的RSD为4.48 ％，表明方法的重现性良好。

2.9加样回收率试验

取重现性用试验样品1共5份，每份精密吸取0.25 mL，分别精密加入S1号盐酸小檗碱对照品溶液溶液4mL (179.63 μg)，按照“2.3 供试品溶液的制备”项下制备样品，按上述色谱条件进样测定，计算盐酸小檗碱含量。加样回收率按如下公式计算，即（测得含量-已知样品中的含量）/加入对照品量×100％，结果显示，盐酸小檗碱的平均回收率为 99.49 ％，RSD为2.33 ％，表明方法加样回收率符合要求。

2.10样品含量测定

采用所建立的HPLC方法分别测定7批连栀矾溶液中盐酸小檗碱的含量及表小檗碱、黄连碱和巴马汀的相对含量，结果见表1。

表1　连栀矾溶液中的表小檗碱、黄连碱、巴马汀和盐酸小檗碱的含量测定结果(n＝3)

含量测定结果表明，7批连栀矾溶液样品中盐酸小檗碱的表小檗碱、黄连碱、巴马汀和盐酸小檗碱的含量未见明显差异，表明7批次样品的质量差异不显著。生产批次靠后的样品7的主要成分含量比其他批次略微高些，但不具备统计学差异意义，初步表明样品的制剂稳定性较好。

3　讨论

试验参照文献方法[12～13]，以连栀矾溶液中君药黄连的主要成分盐酸小檗碱为方法学指标，通过调整流动相组成与比例、检测波长、流速、柱温等色谱条件，达到在较短的时间（12 min）内快速分离并测定盐酸盐酸小檗碱及其相关成分包括表小檗碱、黄连碱、巴马汀的含量。论文建立的HPLC方法快速、精密度高、重现性好，可用于医院制剂连栀矾溶液的定量控制，为其临床疗效的发挥提供重要保障。试验中，通过建立的分析方法，对经一代名医黄济川先生的制备方法和技术制备的近2年的“连栀矾溶液”进行包含表小檗碱、黄连碱、巴马汀和盐酸盐酸小檗碱等成分的分析研究，结果显示出成分含量差异不显著，这在一定程度上表明该医院制剂制备工艺优良且质量较稳定。

[参考文献]

[1]郭永宏.连栀矾溶液加锡类散保留灌肠治疗慢性溃疡性直肠炎的效果分析[J].中国现代药物应用,2014,8(23):193.

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[3]岳朝驰,杨向东.连栀矾溶液加锡类散保留灌肠治疗慢性溃疡性直肠炎36例临床观察[J].中医药导报,2011,17(11) :39.

[4]岳朝驰,杨向东.连栀矾溶液加锡类散保留灌肠治疗慢性溃疡性直肠炎疗效观察[J].结直肠肛门外科,2011,17(5):310.

[5]余腾江,杨向东,理习阳.连栀矾溶液联合康复新液对41例肛漏术后换药的疗效观察[J].云南中医中药杂志,2014,35(1):45.

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[10]贾英田,杨向东,赵希忠.连栀矾溶液纱条促进肛周脓肿术后创面愈合疗效观察[J].结直肠肛门外科,2011,17(4) :254.

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[12]张华,刘敏,李忠东.HPLC法测定芩连平胃汤中小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀含量[J].辽宁中医药大学学报,2014, 16(12):56.

[13]熊巨良.高效液相色谱法测定五味黄连丸中表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的含量[J].湖南中医杂志,2014, 30(9):152.

（责任编辑：何瑶）

Quantitative analysis of epiberberine, coptisine, palmatine and berberine in Lianzhifan Solution by HPLC

YUAN Xuegang1, WANG Zhan-guo2, HU Hui-ling3, YANG Xiang-dong1, ZOU Liang2, YU Teng-jiang1, 4, LIU Qiao3
(1.Chengdu Anorectal Hospital, Chengdu 610037 Sichuan;2.School of Basic Medical Sciences ＆ Nursing, Chengdu University, Chengdu 610106 Sichuan;3.Pharmacy College of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611730 Sichuan; 4.Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000 Sichuan)

[Abstract]Objective: To establish a HPLC method for quantitative analysis of epiberberine, coptisine, palmatine and berberine in Lianzhifan solution.Method: HPLC separation was performed on a Chromstar TM C(18)column (4.6 mm × 250 mm，5 μm) with 0.8 mL．mL(-1)mobile phase, which consisted of acetonitrile-water (0.1％ triethylamine and 0.1％ formic acid, v/v= 30:70).And the detection was set at 345 nm.Result: Epiberberine, coptisine, palmatine and berberine in Lianzhifan solution were separated well in 12 min.The linearity range of berberine was 2.82～44.91 μg．mL(-1)with high linear regression constant.The average recovery was 97.95％.The contents of epiberberine, coptisine, palmatine and berberine of 7 batches Lianzhifan solution were 0.126 ± 0.019, 0.167 ± 0.029, 0.140 ± 0.018, 0.618 ± 0.079 mg．mL(-1).Conclusion: The established HPLC method was efficient, accurate, economical, good precision and high sensitivity.It can be used for rapid quantitative analysis of epiberberine, coptisine, palmatine and berberine in Lianzhifan solution.

[Key words]HPLC; Lianzhifan solution; epiberberine; coptisine; palmatine; berberine

[收稿日期]2015-11-11

[通讯作者]王战国，博士，讲师，从事中医药代谢组学研究Email:wangzhanguo@scu.edu.cn

[作者简介]袁学刚，硕士，副主任医师，从事中医肛肠病临床研究 Tel:13880484566Email: 14472543@qq.com

[基金项目]国家自然科学基金青年基金项目(81403178)；四川省科技厅项目(2015SZ0039、2015FZ0045、2013JY0194)；成都市卫生局项目(20140301)

[中图分类号]R 283.6

[文献标识码]A

[文章编号]1674-926X(2016)01-010-03