HPLC法测定不同产地黄芪中芒柄花苷的含量

禹亚杰，彭腾，尚宁宁，李鸿翔



HPLC法测定不同产地黄芪中芒柄花苷的含量

禹亚杰，彭腾，尚宁宁，李鸿翔

[摘要]目的：测定十批不同产地黄芪药材中芒柄花苷的含量，用以评价不同产地的黄芪的质量，为实际生产和临床应用黄芪药材的选择提供参考。方法：采用80％甲醇回流提取，反相高效液相色谱法进行测定。Diamonsil钻石C(18)色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈：水=25：75等度洗脱；流速：1ml．min(-1)；柱温：30℃；检测波长254nm。结果：内蒙古和山西产的黄芪中芒柄花苷的含量较甘肃与长春高。结论：不同产地的黄芪中芒柄花苷的含量差异较大，同一产地黄芪中的芒柄花苷的含量也存在差异。

[关键词]黄芪；芒柄花苷；HPLC；含量测定

[作者单位]成都中医药大学，四川 成都 611137

黄芪为常见的中草药也是临床常用的中药之一。黄芪(Astragalus, AS)是豆科植物蒙古黄芪 Astragalus mem-branaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao 或 膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根[1]。芒柄花苷是中药黄芪、甘草、葛根等药材中黄酮类化合物的主要成分之一。具有促进皮肤生长、抑制脂质过氧化、清除氧自由基、抑制脂质过氧化、维持血中 NO浓度等多种药理活性。芒柄花苷还具有促进人体肠道中的双歧杆菌和乳酸杆菌生长和抑制肠球菌和肠杆菌生长的作用[2]。本实验在相同条件下测定十批不同产地黄芪中芒柄花苷的含量，为评价不同产地的黄芪的质量以及临床与生产用药的筛选提供参考。

1　仪器与试药

1.1仪器

高效液相色谱仪（岛津LC-20AT），DAD检测器；BP211D型电子天平（德国Sartorius公司）；BP121S型电子天平（德国Sartorius公司）；优普UPT系列超纯水器（成都优普电子产品有限公司）色谱柱：Diamonsil钻石C18（250mm×4.6mm，5μm）

1.2试剂

色谱乙腈和甲醇（美国天地）、超纯水、其他试剂均为分析纯。

1.3对照品

芒柄花苷（自制，HPLC检测纯度＞98％）。

1.4药材

黄芪（十批药材的产地与购入时间见表1），由成都中医药大学中药鉴定教研室龙飞副教授鉴定，均符合2010年版《中国药典》的要求。

表1　十批黄芪药材的产地与购入时间

2　方法与结果

2.1对照品制备

精密称取芒柄花苷对照品0.00202g，甲醇定容至10ml，得浓度为0.202mg．ml-1的对照品溶液备用。

2.2色谱条件

岛津LC-20AT高效液相色谱仪，DAD检测器；色谱柱：Diamonsil钻石C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈：水=25：75；流速：1ml．min-1；柱温：30℃；检测波长254nm。芒柄花苷对照品与黄芪样品的色谱图见图1。

图1　黄芪样品及对照品HPLC色谱图

3　实验结果

3.1线性关系考察

取“2.1”项下对照品采用自动进样法分别进样4,8,12,16,20μL，以“2.2”项下的色谱条件进行测定记录峰面积。以芒柄花苷的进样量（μg）为自变量X，峰面积Y为因变量，作标准曲线。见图2。芒柄花苷的标准曲线为Y=3E+0.6X，r=0.9999，表明进样量在0.802～4.04μg之间线性关系良好。

图2　芒柄花苷标准曲线

3.2精密度考察

取“2.1”项下对照品溶液连续进样6次，每次10μL，计算芒柄花苷峰面积的RSD值为0.56％，表明精密度良好。

3.3重复性考察

取同一供试品连续进样6次，计算芒柄花苷的峰面积的RSD为0.63％，表明重复性良好。

3.4稳定性考察

取同一供试品分别在0、2、4、8、16、24h进样10μL，计算峰面积的RSD为1.38％，表明样品在24h内稳定性良好。

3.5加样回收实验

取已知含量的样品5g，按样品含量的50％、100％、150％加入芒柄花苷对照品，每个浓度平行3份，共 9份样品。按供试品溶液制备项下方法制备供试品，以“2.3”项下色谱条件进行测定，计算回收率,芒柄花苷的平均回收率分别为99.52％、100.36％、100.57％，RSD分别为2.32％、1.04％、2.66％＜3％。表明该方法的准确度良好。具体数据及结果见表2。

表2　加样回收实验结果（n=9）

3.6十批黄芪样品制备及含量测定

精密称取各产地黄芪药材粗粉3份，每份10.00g，加入250ml80％乙醇80℃回流提取两次，每次1h，过滤减压回收溶剂甲醇定容至10ml。用0.45μm微孔滤膜过滤后按“2.2”项下液相条件进行测定，分别进样10μL，记录峰面积，用外标一点法计算含量。具体结果见表3。

表3　十批黄芪中芒柄花苷含量（n=3）

4　讨论

目前对不同产地、用药部位、年限、品种的单味药中黄酮类成分的分离，制备以及含量测定均有比较全面的研究[3～6]，但不同产地的黄芪中芒柄花苷含量测定的报道较少。

从实验结果可以看出内蒙古和山西产的黄芪中的芒柄花苷的含量较高，同一产区内的黄芪样品中芒柄花苷的含量也有所差异。由于产地、采收加工、时间等都可能成为影响芒柄花苷含量的因素，本实验的取样量较少，不能较为全面的评价黄芪药材的质量，仅对芒柄花苷在不同地区的黄芪中的含量分布做一个参考，对于同一产地不同区域以及不同采收时间的黄芪中芒柄花苷的含量还需要进一步研究。

本实验还对HPLC-DAD测定芒柄花苷的液相条件进行了考察，分别考察了不同比例的流动相（甲醇-水和乙腈-水）、流速、柱温以及检测波长。通过对出峰时间、峰的对称性以及样品中峰的分离度等条件的综合考虑，最终选择了乙腈：水=25∶75；流速：1ml．min-1；柱温：30℃；检测波长254nm的液相条件。

在测定不同产地黄芪中芒柄花苷含量的同时，也对黄芪同科植物甘草和葛根中的芒柄花苷的含量[7～8]进行了测定，发现黄芪中芒柄花苷的含量在同科植物中并不是最高的，对于芒柄花苷在同科不同植物中的分布需要进一步研究。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.《中国药典》一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010:283.

[2]张蔚,江曙,钱大玮,等.芒柄花苷与人体肠道细菌的相互作用研究[J].药学学报,2014,08:1162.

[3]付娟,杨世海,黄林芳.超高效液相色谱法同时测定黄芪中6种黄酮类成分的含量[J].中国药学杂志,2013,11:916.

[4]王祖林,韩利文,刘秀河,等.高速逆流色谱法分离制备甘草中的芒柄花苷[J].山东科学,2010,02:18.

[5]程霞,肖朝江,孙俊哲,等.长小苞黄芪化学成分研究[J].大理学院学报,2014,02:3.

[6]季宇彬,姜薇,范玉玲,等.甘草黄酮的研究进展[J].中草药, 2004,09:126.

[7]刘育辰,陈有根,王丹,等.甘草化学成分研究[J].药物分析杂志,2011,07:1251.

[8]王治平,李卫民,高英,等.HPLC同时测定不同产地葛根中6种主要异黄酮类成分的含量[J].中国实验方剂学杂志，2013,08:125.

（责任编辑：胡慧玲）

Content determination of Ononin in Huangqi from different producing areas by HPLC

YU Ya-jie, PENG Teng, SHANG Ning-ning, LI Hong-xiang
(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137,Sichuan)

[Abstract]Objective: The Ononin content in 10 batches of Huangqi from different producing areas were detected to evaluate the quality of Huangqi from different producing areas and provide reference for the selection of Huangqi in production and clinical application.Method: Ononin was extracted using 80％ methanol reflux extraction.HPLC analysis was performed to detect Ononin content.The analysis was carried out on a DiamonsilC(18)(250m×4.6mm, 5μm)column with a mobile phases (acetonitrile : water = 25:75) .The column temperature was 30℃.The flow rate was 1mL．min(-1)and the detection was set at 254nm.Result: Ononin content in Huangqi from Inner Monglia and Shanxi were higher than Gansu and Changchun.Conclusion: Difference can be found in Ononin content in Huangqi from different producing areas.And Ononin content is different in Huangqi from the same producing area.

[Key words]Huangqi; Ononin; HPLC; content determination

[收稿日期]2015-07-13

[通讯作者]彭腾，副教授，硕士生导师，从事中药药效物质基础及质量标准研究Tel:13880376673Email:pengteng1973@sina.com

[作者简介]禹亚杰，女，硕士在读，从事中药有效成分物质基础及质量标准研究工作Email:yuyajie201307@163.com

[基金项目]四川省教育厅重点项目资助课题(10ZA095)；成都市科技攻关项目资助课题(12GGYB346SW-001)

[中图分类号]R282.6

[文献标识码]A

[文章编号]1674-926X(2016)01-006-03