HPLC-DAD同时测定白花蛇舌草中齐墩果酸和熊果酸的含量

王欢，吴莹，黄嫣，李希,，冯建安，王佳



HPLC-DAD同时测定白花蛇舌草中齐墩果酸和熊果酸的含量

王欢1，吴莹1，黄嫣2，李希1,2，冯建安2，王佳1

[摘要]目的：建立HPLC-DAD同时测定白花蛇舌草中齐墩果酸和熊果酸含量的方法。方法：采用Spursil C(18)色谱柱（4.6×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（90∶10∶0.03∶0.06），流速0.5 mL．min(-1)，柱温35℃，检测波长210 nm，进样量10 μL。结果：齐墩果酸和熊果酸分别在0.0218～0.218 μg．μL(-1)(r=0.9997)和0.07312～0.7312 μg．μL(-1)(r=0.9996)范围内线性关系良好，平均回收率分别98.17％(RSD=1.89％)、99.31％(RSD=2.62％)。结论：HPLC-DAD能同时测定白花蛇舌草中齐墩果酸和熊果酸含量，并且该检测方法简便准确、稳定可靠，可用于白花蛇舌草药材的质量控制。

[关键词]白花蛇舌草；HPLC-DAD；齐墩果酸；熊果酸

[作者单位]1.成都中医药大学药学院，四川 成都 610075；2.四川省中医药科学院中医研究所，四川 成都610031

白花蛇舌草始载于《广西中药志》，为茜草科耳草属植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd.的干燥全草[1]。本品具有清热解毒、利湿消肿、活血止痛等功效，临床上广泛用于恶性肿瘤、胃肠炎、阑尾炎、泌尿系统感染、扁桃体炎、肺炎等[2]。白花蛇舌草主要化学成分有萜类、黄酮类、蒽醌类、苯丙素类、香豆素类、挥发油类、含酸化合物、多糖类及其他类[3]。白花蛇舌草具有良好的抗肿瘤、抗氧化、抗化学诱变、抗菌消炎等药理活性作用，因此在临床中应用广泛，尤其在肿瘤的预防和治疗中起着不可或缺的作用[4～5]。有研究报道齐墩果酸（OA）和熊果酸（UA）是其抗肿瘤的主要活性物质。白花蛇舌草作为一种临床治疗癌症和各种炎症的常用中药，2010版《中华人民共和国药典》仅在附录中收录了白花蛇舌草的来源，而《四川省中药材标准》收录的白花蛇舌草的质量标准也不完善，缺少含量测定的定量分析。因此对白花蛇舌草中主要活性成分OA 和UA进行定量分析，可为白花蛇舌草的质量控制和进一步开发应用提供一定的参考依据。

OA和UA的检测方法一般有紫外分光光度法[6]、薄层扫描法[7]和高效液相色谱法[8]。高效液相色谱法具有分析速度快，分离效能高，应用范围广及灵敏度高的特点。文献中虽有报道利用高效液相色谱法测定OA和UA的含量，但二者属于同分异构体，分离度和峰形均不理想，并且出峰时间长。本实验通过HPLC-DAD建立了同时测定白花蛇舌草中OA和UA的含量。该方法简便，稳定可行，出峰时间短，可用于白花蛇舌草的质量控制方法。

1　仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司），DAD检测器（美国安捷伦科技有限公司），KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），BT 125D型电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司），艾科浦分析型AUP-2-35G-1实验室纯化水机（颐洋企业发展有限公司）。

白花蛇舌草药材购自四川省新荷花中药饮片股份有限公司，经由四川省第二中医院李希教授鉴定为茜草科耳草属植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）的干燥全草。齐墩果酸对照品（OA，中国食品药品检定研究院，批号：110709-201206），熊果酸对照品（UA,中国食品药品检定研究院，批号：110742-201220），甲醇（色谱纯，美国Fisher公司），三乙胺（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），水为超纯水（实验室自制），其余试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件

Spursil C18色谱柱（4.6 ×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（90∶10∶0.03∶0.06），流速0.5 mL．min-1，柱温35℃，检测波长210 nm，进样量10 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取OA和UA对照品适量，用甲醇分别配制成含OA0.545 mg．mL-1，UA0.914 mg．mL-1的对照品储备液，精密量取对照品储备液适量制成含OA0.109 mg．mL-1，UA0.3656 mg．mL-1的对照品混合溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 准确称取白花蛇舌草粉末约1.00 g，至于100 mL具塞锥形瓶中，加入50 mL乙醇溶液，超声提取30 min，过滤，水浴蒸干，取适量甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶中，定容，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.3检测波长的选择

精密吸取对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，于二极管阵列检测器（DAD）下190～400 nm范围内进行全波长扫描，结果显示在205 nm处，OA 和UA有最大吸收，但考虑到甲醇的截止波长为205 nm，对测定产生一定的影响。而在210 nm处，溶剂峰对OA和UA干扰小，且分离度好，故最终确定吸收波长为210 nm。

2.4方法学考察

2.4.1系统适应性 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果表明，在该色谱条件下，OA和UA分离度达到1.77，OA和UA的理论塔板数均大于6000，能达到检测要求（图1）。

图1　白花蛇舌草HPLC图

2.4.2线性关系考察 取对照品储备液一定量，加甲醇稀释成含OA0.218，0.109，0.087 2，0.065 4，0.043 6，0.021 8 mg．mL-1，UA0.731 2，0.365 6，0.292 5，0.219 3，0.146 3，0.073 12 mg．mL-1的一系列对照品混合溶液。分别精密吸取上述对照品混合溶液10 µL，依次注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以对照品质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得OA和UA的回归方程分别为：Y=144 14X－29.854(r=0.9997)，Y=11282X －72.516（r=0.9996）。结果表明，OA在0.0218～0.218 μg．μL-1范围内，线性关系良好。UA在0.07312～0.7312 μg．μL-1范围内，线性关系良好（见图2、图3）。

图2　OA标准曲线

图3　UA标准曲线

2.4.3精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下的对照品溶液10 μL，并按上述色谱条件重复进样6次，计算OA 和UA的峰面积RSD分别为1.71％，0.87％，表明方法精密度良好。

2.4.4稳定性试验 分别精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液和“2.2.2”项下供试品溶液各10 μL，分别于0，2，4，8，12，24 h时按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果对照品溶液中的OA、UA峰面积的RSD分别为1.71 ％、0.87 ％，供试品溶液中的OA、UA峰面积的RSD分别为1.83 ％、1.06％，均小于2％，表明对照品和供试品在24 h内稳定性良好。

2.4.5重复性试验 对同一批白花蛇舌草样品，分别取样6份，按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下的测定方法进行测定。结果OA和UA的平均含量分别为0.513 5 mg．g-1，2.223 8 mg．g-1，RSD分别为0.68％和0.91％，表明该方法的重复性良好。

2.4.6加样回收率试验 精密称取白花蛇舌草样品9份，每份0.3g，分别置于具塞锥形瓶中，分别按低、中、高三个水平加入OA和UA的对照品溶液，平行三份，按“2.2.2”项下方法提取，并按“2.1”项下的色谱条件进行测定，计算回收率。结果得OA的平均回收率为98.17％ ，RSD为1.89％，UA的平均回收率为99.31％，RSD为2.62％。见表1。

表1　OA、UA加样回收率试验

2.4.7含量测定 取5个不同产地的白花蛇舌草样品，每个产地各2批，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下的色谱条件进行测定。结果见表2。

表2　不同产地白花蛇舌草的含量测定结果

3　讨论

本实验中根据OA和UA易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，不溶于水的理化性质，分别考察了甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮对提取的影响，结果表明，甲醇、乙醇的提取率明显高于乙酸乙酯和丙酮，考虑到原料成本以及溶剂的安全性问题，采用乙醇为提取溶剂。以乙醇为提取溶剂，分别对加热回流，索氏提取，超声提取进行了单因素考察。结果显示超声提取和回流提取明显优于索氏提取，但超声提取操作简单，省时省力，所以选择超声法作为白花蛇舌草中OA和UA的提取方法。

OA和UA属于五环三萜类的一对同分异构体，结构相似，仅是E环上的一个甲基的位置不同。一般的色谱条件很难将二者达到基线分离。曾尝试不同比例的甲醇-2％醋酸，甲醇-1％醋酸，乙腈-水，甲醇-0.1％磷酸，甲醇-0.5％磷酸的流动相，OA和UA的分离度均未达到检测要求，并且峰形不好，有的出峰时间长。在查阅相关的文献基础上，发现加入三乙胺能很好地改善峰形，并且低流速能提高二者的分离度，通过调节甲醇-水-冰乙酸-三乙胺之间的比例，最终确定流动相为甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（90：10：0.03：0.06），流速为0.5 mL．min-1，二者分离度达到1.77，符合检测要求。该方法重复性好，稳定可靠，可用于白花蛇舌草药材中OA和UA定量分析和质量控制。

通过对5个不同产地白花蛇舌草中OA和UA进行含量测定后发现，不同产地的白花蛇舌草含量存在明显的差异，其中河南、江苏产地中OA、UA的含量较高。因此，白花蛇舌草质量标准的建立需要深入系统的研究。白花蛇舌草中化学成分复杂，指标性成分或有效成分的制备以及质量标准尚未建立，本文以OA和UA为指标成分，对白花蛇舌草质量标准的研究具有一定的参考价值。

[参考文献]

[1]四川省食品药品监督管理局.四川省中药材标准[S].成都：四川科学技术出版社,2010,180.

[2]陈永康.白花蛇舌草的化学成分研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2011:17(17),290.

[3]廖婵婵,刘鸿.白花蛇舌草的化学成分与药理作用研究进展[J].中国医药,2012,7(11):1487.

[4]刘盼盼,姚晓东,李洁.白花蛇舌草化学成分及药理作用研究进展[J].中国药业,2011,20(21):96.

[5]纪宝玉,范崇庆,裴莉昕,等.白花蛇舌草的化学成分及药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(19):236.

[6]辛爱学,金鑫.白花蛇舌草与水线草中齐墩果酸的含量测定[J].中国现代药物应用,2009,3(2):8

[7]卢文彪.薄层扫描法测定白花蛇舌草中齐墩果酸含量[J].时珍国医国药,2001,12(11):961

[8]布海里且木.阿里,李桂荣,闫波,等.HPLC测定香青兰中齐墩果酸和熊果酸的含量[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(15):81

(责任编辑：李芸霞)

Simultaneous determination of oleanolic acid and ursolic acid in Baihuasheshecao by HPLC-DAD

WANG Huan1, WU Ying1, HUANG Yan2, LI Xi1,2, FENG Jian-an2, WANG Jia1
(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine sciences, Pharmacy School, Chengdu 610075, China;2.Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine sciences, Institute of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610031, China)

[Abstract]Objective: To establish a HPLC-DAD method for simultaneous determination of oleanolic acid and ursolic acid in Baihuasheshecao.Method: The separation was performed on the Spursil C(18)column (4.6 mm×250 mm, 5 µm) with methanolwater-glacial acetic acid-triethylamine (90:10:0.03:0.06) as mobile phase.The detection wavelength was 210 nm.The flow rate was 0.5 mL．min(-1).The column temperature was 35℃, and the injection volume was 10 μL.Result: The linear response of oleanolic acid and ursolic acid were 0.0218～0.218 μg．μL(-1)(r=0.9997) and 0.07312～0.7312 μg．μL(-1)(r=0.9996) respectively.The average recovery of oleanolic acid and ursolic acid were 98.17％ and 99.31％, with RSD of 1.89％ and 2.62％ respectively.Conclusion: HPLC-DAD can be used to simultaneously detect oleanolic acid and ursolic acid in Baihuasheshecao.The detection method is simple, accurate, reliable and can be used for quality control of Baihuasheshecao.

[Key words]Hedyotis diffusa willd.; HPLC-DAD; oleanolic acid; ursolic acid

[收稿日期]2015-05-29

[通讯作者]李希(1969-)，女，硕士，教授，主要从事中药新制剂、新技术、新工艺方向研究Tel:18030897734 Email:1836820767@qq.com.

[作者简介]王欢(1989-)，女，在读硕士研究生，主要从事中药新制剂、新技术、新工艺方向研究Tel:18380228305 Email:928451725@qq.com.

[基金项目]四川省省级公益性科研院所基本科研项目(14-4-422)

[中图分类号]R 284.1

[文献标识码]A

[文章编号]1674-926X(2016)01-007-03