HPLC和TLC法对蓝色签字笔墨水分类鉴定研究

陈明星等

[摘 要] 结合薄层色谱法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC），分析市售32种不同厂家、不同品牌以及同一品牌不同规格的蓝色签字笔油墨成分。首先采用正丁醇：无水乙醇：水：冰醋酸=6：2：2：1（体积比）为展开剂，用TLC法对32支不同产地不同牌号蓝色签字笔字痕分析，再以甲醇-NH4HCO3缓冲盐体系为流动相，流速0.8mL/min进行高效液相色谱分析。根据色谱峰个数，可将32种蓝色签字笔分成9类。

[关键词] 高效液相色谱； 薄层色谱； 蓝色签字笔； 分类

中图分类号：O657 文献标识码： A 文章编号：2095-5200（2015）04-061-04

[Abstract] Thin layer chromatography （TLC） and high performance liquid chromatography （HPLC） were employed to analyze the components contained in 32 different blue gel pen inks in this study. The components of 32 blue gel pen inks were analyzed by TLC with developing solvent containing n-butanol： ethanol： water： glacial acetic acid=6： 2： 2： 1. A better separation was archived using HPLC with mobile phases containing ammonium acid carbonate. The two methods are complementary to each other. This analysis of blue gel pen inks was found to be effective and credible.

[Key words] High performance liquid chromatography；Thin layer chromatography；Blue gel pen inks；Classification

前言

签字笔由于具有书写流畅、色彩鲜艳及价廉、环保等特点，逐渐成为人们最常用的笔种之一。在各类刑事、经济案件及民事纠纷中，经常涉及到有关蓝色签字笔字迹检验和鉴定。签字笔墨水主要由溶剂、染料、增稠剂、稳定剂和添加剂等组成。不同厂家或同厂家不同牌号签字笔中成分有所不同，特别是其中的染料组成会有一些差异，这就为签字笔种类鉴别提供依据。目前有关墨水分析的光谱法有红外光谱法[1-2]、拉曼光谱法[3]；色谱法有薄层色谱法[4-5]，高效液相色谱法[6-7]、毛细管电泳[8-9]等；还有用质谱法鉴定墨水中染料的研究[10]。在这些分析方法中，光谱法特别是红外和拉曼光谱法是无损分析，在墨水分类鉴定中发挥很大作用，但是由于墨水成分复杂，这些方法识别率相对较低[11-13]。与无损方法相比，有损和半有损的色谱方法识别率相对较高[14-16]。为此，本文首先用TLC对收集的蓝色签字笔进行分析，根据斑点个数、颜色以及比移值将其分为9类。在此基础上，使用HPLC以NH4HCO3缓冲盐体系为流动相，进行分离、分类。将HPLC与TLC分类结果进行比较，为更准确地区分蓝色签字笔墨水种类提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器 Waters 600高效液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列检测器，Waters 717 Plus自动进样器（Waters公司，美国）；色谱柱为Purospher STAR C18色谱柱（Merck公司，德国），Millipore超纯水器（Millipore公司，美国）；微孔滤膜（0.45μm）。

1.1.2 试剂 甲醇、无水乙醇、异丙醇、正丁醇、冰醋酸、乙酸乙酯、丁酮、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）等为分析纯。乙腈、甲醇为色谱纯（Merck公司，德国）。

1.1.3 样品 由中国、美国、英国、日本、德国以及中国台湾等地生产的32支市售蓝色签字笔。

1.2 实验方法

1.2.1 实验条件 薄层色谱条件：实验使用德国Merck硅胶GF254层析板。展开剂为正丁醇： 无水乙醇： 水： 冰醋酸=6： 2： 2： 1。

HPLC条件：采用甲醇（A）-碳酸氢铵（0.01mol/L）（B）为流动相进行梯度洗脱，A相起始比例为45%，20min内上升至67%，保持该比例至60min；柱温：25 ℃；流速0.8mL/min；进样量：10μL；检测波长580nm。

1.2.2 样品制备 将每支染料型蓝色签字笔在纸张上书写笔道，用洁净手术刀片取长2cm、宽0.5cm的笔道，剪碎，加入200μL60%甲醇，提取10min后，移出色痕提取液，用0.45μm滤膜过滤，使用HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 蓝色签字笔字迹提取液TLC结果

对市售的32支不同国家和地区、不同牌号的蓝色签字笔字痕提取液进行TLC分析。通过斑点个数、颜色、比移值Rf差异可以将蓝色签字笔分为9类（见表1）。

2.2 蓝色签字笔字痕提取液的分析

采用二极管阵列检测器进行全波段扫描，发现蓝色签字笔中染料最大吸收波长在670～500nm之间。考察纸张中物质如增白剂等对签字笔色谱峰影响，发现纸张中物质最大吸收峰位置均在350nm以下，可以认为纸张对签字笔墨水分析没有影响。

用HPLC对这些签字笔样品进行分离、分析，通过色谱图中主要峰保留时间及所对应的紫外光谱图差异，也可将蓝色签字笔墨水分为9类，各类蓝色签字笔字痕提取液色谱图（见图1）。

由于各染料成分最大吸收波长不同，在580nm波长下，可以看到大部分物质色谱峰（图1），但是有个别物质的色谱峰在图上很小甚至看不到，需要在其他波长下才能看到，如第八类中的峰7的最大吸收峰为520nm，第九类中的峰9在660nm有最大吸收峰（见图2）。

2.3 TLC斑点和HPLC色谱峰比对分析

为了确定TLC中的斑点与HPLC中色谱峰对应关系，将每支笔样品在薄层板上平行点20个样，经薄层展开后将颜色相同且Rf值相同的斑点刮下收集，加入一定量60%甲醇后过微孔滤膜，然后进行HPLC分析。

经HPLC分析发现，在TLC分析中所得到的斑点并不一定是纯的化合物，有些是由2个或3个色谱峰组成，如Rf 0.39的铜绿斑点，其主要成分对应第一至五类色谱图中的峰1（lmax=630nm）。另外，在这个色谱峰前面还有一个含量较少的物质，其最大吸收波长也是630nm。这种现象主要是由于染料不纯造成，例如甲基紫染料实际上是由结晶紫、甲基紫和碱性品蓝3种物质的混合物；碱性艳蓝B和碱性艳蓝BO中也都含有少量脱甲基和脱乙基衍生物[10]。

将薄层色谱所得到分类结果与液相色谱法分类结果进行比较，可以发现：第一至五类色谱峰，均有一个Rf 0.39铜绿色的斑点，其对应色谱图峰1（t=10.4min，lmax=630nm）。对于第二、三、四、六类笔，都有Rf 0.46的亮粉红色斑点，在色谱图上对应为峰2（t=30.0min，lmax=560nm）。在第一、三、七、九类色谱图可以看出在38.2min位置都有一个较大的主峰，对比薄层的斑点，可知该峰对应Rf 0.60蓝色斑点，为峰4（t=38.2min，lmax=610nm）。对应于Rf 0.60紫色斑点物质的最大吸收波长可在590nm下观察到的，其存在于在第六和八类色谱图中，对应峰3（t=37.8min，lmax=593nm）。第四类薄层上有Rf 0.7蓝色斑点，对应其色谱图上峰5（t=52.1min，lmax=615nm）。第五类薄层上有Rf 0.7的紫色斑点对应于色谱峰6（t=31.1min，lmax=615nm）。观察第八类和第五类色谱图，图上的峰7（t=30.0min，lmax=520nm）和峰8（t=45.4min，lmax=550nm）分别对应于具有荧光性质的Rf 0.85的黄色和Rf 0.8的浅粉红色斑点。峰6与峰7位置相近，区别在于峰6物质最大吸收波长为615nm，而峰7最大吸收波长520nm，并非同一物质。峰7对应物质色谱峰只有在520nm下才能看到（图1-b）。第九类图中峰9（t=2.5min，lmax=660nm）对应薄层中Rf 0.0铜绿色

斑点。

签字笔是近20年左右出现的新笔种，由于商业秘密原因，人们对其中染料成分知道的并不多，但是可以通过TLC分离其中成分并根据斑点个数、颜色和比移值进行分析鉴定，也可以利用高效液相色谱法或毛细管电泳法来进行分析、分离鉴定。

2.4 蓝色签字笔的树形分类图

根据上述实验分类及对比，建立如下树形模式识别（见图3）。在此基础上，对于组成相同的笔，可以选择特定波长下（如580nm）各个色谱峰的相对面积比进行进一步区分[7， 9]。

3 结论

用薄层色谱法和高效液相色谱系统地对32支蓝色签字笔书写字迹中染料进行研究，能够在所得实验条件下很好地分离蓝色签字笔中各类不同染料，对比2种方法所得实验结果，可将蓝色签字笔墨水分为9类。将这2种分析方法结合使用，可以快速、准确地对蓝色签字笔墨水进行分类。

参 考 文 献

[1] Zieba-Palus J， Kumicki M. Application of the micro-FTIR spectroscopy， Roman spectroscopy and XRF method examination of inks [J]. Forensic Science International，2006，185（5）：164-172.

[2] Kher A， Mulholland M， Green E， et al. Forensic classification of ballpoint pen inks using high performance liquid chromatography and infrared spectroscopy with principal components analysis and linear discriminant analysis [J]. Vibrational Spectroscopy，2006，40：270-277.

[3] 徐彻，汤纯，杨延勇，等. 显微激光拉曼光谱法鉴别黑色圆珠笔油墨的初步研究[J]. 法医学杂志，2000，16（4）：244-245.

[4] 黄娟娟，贺江南. 蓝色中性笔色痕种类的薄层色谱法分析[J]. 中国人民公安大学学报（自然科学版），2007，56（1）：1-4.

[5] 王志勇，王炳娟，邹洪. 薄层色谱法鉴别黑色签字笔油墨的种类[J]. 理化检验：化学分册，2009，45（1）：14-15.

[6] Samanidou V F， Nikolaidou K I， Papadoyannis I N. Development and validation of a gradient-HPLC-PDAD method for the identification of ballpoint pen ink components： study of their decomposition on aging for forensic science applications [J]. Journal of liquid chromatography & related technologies，2004，27（2）：215-235.

[7] 许荣富，刘克林，王燕军，等. 高效液相色谱法用于蓝色圆珠笔分类的研究[J]. 理化检验：化学分册，2008，23（5）：281-283.

[8] Fakhari A R， Breadmore M C， Macka M， et al. Non-aqueous capillary electrophoresis with red light emitting diode absorbance detection for the analysis of basic dyes [J]. Analytica Chimica Acta，2006，580（2）：188-193.

[9] Zou Hong， Wang Zhiyong， Ye Nengsheng， et al. NACE discrimination of black pen inks [J]. Chromatographia，2008，67（6）：483-486.

[10] Ng L K， Lafontanie P， Brazeau L. Ballpoint pen inks：characterization by positive and negative ion-electrospray ionization mass spectrometry for the forensic examination of writing inks [J]. Journal of Forensic Science，2002，47（4）：1238-1247.

[11] Dirwono W， Park J S， Agustin-Camacho M R， et al. Application of micro-attenuated total reflectance FTIR spectroscopy in the forensic study of questioned documents involving red seal inks [J]. Forensic Science International，2010，199（3）：6-8.

[12] Causin V， Casamassima R， Marega C， et al. The discrimination potential of ultraviolet-visible spectrophotometry， thin layer chromatography， and Fourier transform infrared spectroscopy for the forensic analysis of black and blue ballpoint inks [J]. Journal of Forensic Sciences，2008，53（6）：1468-1473.

[13] Huang T H， Wu T M. Spectral analysis of ball pen script by FTIR microscope with ATR objective [J]. Spectroscopy and Spectral Analysis，2007，27（11）：2200-2202.

[14] Yao Y T， Song J， Yu J， et al. Differentiation and dating of red ink entries of seals on documents by HPLC and GC/MS [J]. Journal of Separation Science，2009，32（17）：2919-2927.

[15] Wang X F， Yu J， Xie M X， et al. Identification and dating of the fountain pen ink entries on documents by ion-pairing high-performance liquid chromatography [J]. Forensic Science International，2008，180（1）：43-49.

[16] Poon N L， Ho S S H， Li C K. Differentiation of coloured inks of inkjet printer cartridges by thin layer chromatography and high performance liquid chromatography [J]. Science & Justice，2005，45（4）：187-194.