人参皂苷Rg1对MC3T3-E1成骨细胞增殖分化的相关研究①

段　峰,栗　秋,赵　刚

(1.佳木斯大学附属第二医院口腔医院,黑龙江 佳木斯 154002；2.佳木斯大学研究生学院，黑龙江 佳木斯 154007)



人参皂苷Rg1对MC3T3-E1成骨细胞增殖分化的相关研究①

段峰1,栗秋2,赵刚1

(1.佳木斯大学附属第二医院口腔医院,黑龙江 佳木斯 154002；2.佳木斯大学研究生学院，黑龙江 佳木斯 154007)

摘要：目的:研究人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1,简称Rg1)对MC3T3-E1小鼠成骨细胞增值、分化及迁移能力的影响。方法:采用不同浓度人参皂苷Rg1,1×10-1mg/mL、1×10-2mg/mL、1×10-3mg/mL、1×10-4mg/mL、1×10-5mg/mL对MC3T3-E1进行CCK-8细胞增值的影响，采用ALP进行细胞分化的检测。结果:与标准组对比Rg1浓度在1×10-3mg/mL时可明显促进细胞增殖,分化(P<0.05)。结论:人参皂苷Rg1可促进MC3T3-E1成骨细胞增殖分化。

关键词:人参皂苷Rg1；小鼠成骨细胞MC3T3-E1;细胞增殖；分化

面对颌面部损伤患者数量的不断增加，颌面部骨缺损逐渐被人们所关注。同时人们对于牙齿美观的要求也逐步加强，正畸学的研究方向也从矫治力学向牙齿移动生物学方向延伸。颌面部骨组织的新生与吸收以及牙槽骨的新生与吸收一直是医生所关注的方向与重点。中国传统中药促骨骼愈合，多年来在临床与科研方面一直被人们所追寻。人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1，简称Rg1)主要来源于，五加科人参属人参的根中，是其主要有效成分[1]。人参主补五脏，能增强机体免疫力，抗休克、增强骨质也有一定的治疗作用[2,3]。人参皂苷Rg1，其结构主要为四环三萜类衍生物，晶性粉末(正丁醇-甲基乙基酮或甲酸乙酯)。已有实验证实腹腔注射100mg/kg, 4h后Rg1使骨髓细胞的DNA的生物合成明显增加。本实验从细胞角度，研究Rg1对成骨细胞增值，分化，迁移的影响，不仅为临床实践，体外实验提供理论依据，同时也是生物药学追寻的热点。

1材料方法

1.1主要试剂

人参皂苷Rg1标准品(上海金穗生物科技有限公司HPLC≥98%)、成骨细胞MC3T3-E1(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)、胎牛血清(Gibco公司)、青霉素链霉素溶液-双抗(HyClone海可隆公司)、0.25%胰蛋白酶消化液(HyClone海可隆公司)、PBS(碧云天生物技术研究所)、95%无水乙醇(天津市巴斯夫化工有限公司)、Cell Counting Kit-8(BOSTER博士德生物) 、ALP试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2主要仪器

电子天平(Ohaus,美国)、Olympus显微镜(日本Olympus显微镜)、酶标仪(Takara,日本)、,S-3400N型扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)、CO2培养箱(美国ThermoForma公司)。

1.3方法

1.3.1细胞的准备

小鼠前成骨细胞株 MC3T3 E1源于上海中科院细胞库。MC3T3 E1细胞置于基本培养液中，在37℃5%CO2饱和湿度的培养箱中常规培养。每2~3d换液1次，待细胞融合至80%~90%时，用0. 25%胰蛋白酶消化，悬成 1×10-5/mL的密度备用。

1.3.2人参皂苷Rg1浓度配制

将购买纯度大于98%的人参皂苷Rg1 10mg分别溶解于10mL溶液中，溶液含总体积2%的无水乙醇，总体积98%的培养液，配成终浓度为1mg/mL的人参皂苷Rg1，用10倍稀释法，逐梯度配制出1×10-1mg/mL、1×10-2mg/mL、1×10-3mg/mL、1×10-4mg/mL、1×10-5mg/mL的人参皂苷Rg1溶液，置于离心管中外用锡纸遮住避光备用。

1.3.3细胞增殖能力检测CCK-8

取1块96孔板，将其分为8组，即1个对照组、7个实验组，每组5个复孔，用0.25%的胰酶消化悬浮成骨细胞，调整细胞密度为1×105/mL，各组均加入100μL的细胞悬液。置37℃、饱和湿度5%CO2细胞孵育箱培养，培养24h后，细胞贴壁。对照组不加任何试剂；7个实验组各加入浓度分别为1mg/mL、1×10-1mg/mL、1×10-2mg/mL、1×10-3mg/mL、1×10-4mg/mL、1×10-5mg/mL的人参皂苷Rg1 100μL，置37℃温箱。细胞培养，并分别于24h，48h，72h取出96孔板，去除上悬液，并用PBS清洗，后加入20μL CCK-8检测试剂，避光入37℃、饱和湿度，5%CO2细胞孵育箱中培养4 h取出用酶标仪测吸光度值激发光波长为450nm。

1.3.4细胞分化能力检测ALP

取96孔板，将其分为6组，即1个对照组，5个实验组，调整细胞浓度为1 × 105孔/mL，每组5个复孔加入100μL的细胞悬液。置37℃、饱和湿度、5%CO2细胞孵育箱培养，培养24h后，细胞贴壁。对照组不加任何试剂；实验组各加入浓度分别为1×10-1mg/mL、1×10-2mg/mL、1×10-3mg/mL、1×10-4mg/mL、1×10-5mg/mL的Rg1 100μL，置37℃温箱。分别于3d，7d，14d取出按碱性磷酸酶ALP测试盒说明书进行检测。

1.4统计学方法

采用SPSS软件17.0版本进行方差分析。用所有实验数据用均数士标准差表示，P<0.05有统计学意义。

2结果

2.1 CCK-8检测细胞增殖结果

人参皂苷Rg1在24h、48h、72h时1×10-1~1×10-5mg/mL浓度范围内可明显促进细胞增殖，且1×10-3mg/mL时细胞增殖最为明显。但在24h时，Rg1浓度为1mg/mL与1×10-6mg/mL时所测数值与标准组相对比时无意义(P>0.05)。见表1。

组别24h48h72h标准组0.108±0.0220.149±0.0330.203±0.0211mg/mL0.109±0.1121×10-1mg/mL0.142±0.0100.250±0.0850.298±0.0331×10-2mg/mL0.154±0.0470.300±0.0920.501±0.0151×10-3mg/mL0.218V0.0480.476±0.1210.807±0.0181×10-4mg/mL0.148±0.0150.292±0.0810.606±0.0151×10-5mg/mL0.140±0.0080.30±0.0680.527±0.0551×10-6mg/mL0.140±0.118

注:1)24h时1mg/mL与1×10-6mg/mL数值无统计学意义(P>0.05)；2)其他浓度数值与标准组相比有统计学意义(P<0.05)。

2.2ALP检测细胞分化结果

人参皂苷Rg1的不同浓度1×10-1~1×10-5mg/mL在3d，7d，14d与标准组相对比，随时间的增长ALP活性相对增加，且在1×10-3mg/mL时活性最为明显(P<0.05)。见表2。

表2　ALP检测不同浓度Rg1对MC3T3-E1分化

注：与标准组相比有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

面对日益增多的正畸病例以及颌面外科骨损伤患者，牙槽骨吸收、形成和稳定，颌面部骨组织破损的修复与形成，无疑与骨组织的形成紧密相关，因而颌面部促进骨组织形成已成为当前解决口腔颌面部骨损伤的首要问题。骨的形成要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟，细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡四个阶段，起始阶段成骨细胞的增殖无疑奠定了骨形成的重要基础，成骨细胞因此可称为骨形成中必不可少的结构[4]。成骨细胞增殖期细胞数量增加，以形成多层细胞，并合成分泌Ⅰ型胶原以便最终可以矿化形成骨结节，进而修复骨缺损，因此成骨细胞对骨组织的生长发育，损伤修复，骨代谢平衡与骨量维持起着关键作用[5,6]。

我国传统中药人参是著名的强壮滋补药，人参皂苷Rg1是人参中主要的活性成分，可促进体外培养的神经干细胞，骨髓基质细胞等多种细胞的增殖和分化。人参皂苷可促进骨形成，能有效预防去卵巢大鼠的骨量丢失。因此，本实验选用不同浓度的人参皂苷Rg1与成骨细胞进行培养，并观察成骨细胞增殖、分化情况[7]。

Cell Counting Kit-8细胞增值及细胞毒性检测盒(简称CCK-8)是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增值和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。本实验CCK-8于24h Rg1浓度1mg/mL与1×10-6mg/mL数值与标准组相比无统计学意义(P>0.05)，因此本实验最终浓度确定为1×10-1mg/mL、1×10-2mg/mL、1×10-3mg/mL、1×10-4mg/mL、1×10-5mg/mL，由数据显示，与标准组相比实验组浓度随时间梯度，成骨细胞增殖能力不断增加，1×10-3mg/mL时细胞增殖最为明显，人参皂苷Rg1可促进成骨细胞增殖。

碱性磷酸酶在骨和牙齿等矿化组织形成中起着重要作用。ALP活性增高被认为是组织发生矿化的前提条件，通过测定ALP活性，可以反映骨分化的能力，本实验数据显示，14d时细胞分化程度最好，且浓度于1×10-3mg/mL时ALP活性明显高于其他实验组，人参皂苷Rg1可促进成骨细胞ALP活性。

本实验通过以上结果与讨论，证实人参皂苷Rg1可促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖、分化。对颌面部成骨细胞形成有促进作用，此实验可为临床实践，体外实验提供理论依据。

参考文献:

[1]Gong L, Li S L,Li H,et al.Ginsenoside Rg1 protects primary cultured rat hippocampal neurons from cell apoptosis induced by β-amyloid protein[J].Pharm Biol,2011,49(5):501-507

[2]Fang F,Chen X,Huang T,et al.Multi-faced neuroprotective effects of Ginsenoside Rg1 in an Alzheimer mouse model[J].Biochim Biophys Acta,2012,1822(2):286-292

[3]Shi A W,Gu N,Liu X M,et al.Ginsenoside Rg1 enhances endothelial progenitor cell angiogenic potency and prevents senescence in vitro[J].J Int Med Res,2011,39(4):1306-1318

[4]庄朋伟，张艳军，庞坦.人参皂苷Rg1 促进体外培养神经干细胞增值的研究[J].中国中药杂志，2009,34(4)：443-446

[5]陈述祥，康乐.中药促成骨细胞增值和分化的基质与作用[J].中国组织工程研究，2012,16(7)：1299-1302

[6]ThomasM Bodenstine，Benjanmin H Beck,Leah M Cook，et al.Pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells promote breast cancer growth in bone in a murine xenograft modle[J].Chinese Journal of Cancer,2011,03(7):123-125

[7]王萍，周玥，王亚平.人参皂苷Rg1促进人牙周膜干细胞增殖与成骨分化[J].第三军医大学学报，2013,15:1566-1569

(收稿日期：2015-06-09)

中图分类号：R782.2

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2016)01-0094-02

作者简介:段峰(1972~)男，黑龙江佳木斯人，学士，副主任医师，副教授，硕士研究生导师。通讯作者:栗秋(1989~)女,黑龙江哈尔滨人，在读硕士研究生。E-mail：970601377@qq.com。