奥卡西平对戊四氮致癫大鼠脑组织内MMP-2、MMP-9表达的干预作用①

孟胜男，金玉玲

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)



奥卡西平对戊四氮致癫大鼠脑组织内MMP-2、MMP-9表达的干预作用①

孟胜男，金玉玲

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

摘要：目的：通过戊四氮建立大鼠致癫模型，研究奥卡西平(oxcarbazepine，OXC)对大鼠脑组织内MMP-2与MMP-9表达的干预情况。方法：采用SD雄性大鼠(SPF级)，随机分为正常组、戊四氮致癫组以及戊四氮致癫加高中低浓度奥卡西平组。正常组给予生理盐水、戊四氮组给予35mg/kg剂量，戊四氮加奥卡西平组高剂量200mg/kg、中剂量100mg/kg、低剂量组50mg/kg。记录大鼠行为学情况及大鼠疲劳仪上停留时间，应用Real-time PCR方法分析MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达量在各组间含量的差异。结果：用戊四氮制备的大鼠癫痫模型，MMP-2与MMP-9表达明显上调，在奥卡西平灌药3周起就能够显著降低MMP-2与MMP-9表达，并且呈现剂量相关性。RT-PCR结果表明正常组的MMP-9与MMP-2的mRNA与蛋白表达水平都处于较低的水平，当注射戊四氮后，MMP-2与MMP-9明显上调(P<0.01，P<0.01)，当灌注不同剂量的奥卡西平之后，MMP-9与MMP-2的表达明显下调，200mg/kg奥卡西平组已接近正常组水平。结论：奥卡西平通过对大鼠脑组织内MMP-2、MMP-9表达的干预，对戊四氮致癫大鼠脑组织结构和功能具有保护作用，此保护作用具有剂量相关性。

关键词：奥卡西平；戊四氮致癫大鼠；MMP-2表达；MMP-9表达

癫痫是脑部的一种慢性疾患,是一组由大脑神经元高度同步化异常放电所引起的短暂中枢神经系统功能失常为特征的脑部疾病[1]癫痫至今尚无根治的方法，因此癫痫的治疗成为国内外研究的重点[2]基质金属蛋白酶(MMPs)是Zn2+和Ca2+依赖性蛋白水解酶。MMPs能催化降解细胞外基质所有成分。MMPs家族中MMP-2、MMP-9的作用较为重要，并且在中枢神经系统神经元中MMP-2、MMP-9高度表达。研究发现MMP-9通过降解基底膜,破坏血脑屏障(BBB)[3~7]。另外有文献报道在戊四氮致癫模型大鼠中，大脑组织发生严重损伤，血脑屏障通透性降低，同时发生炎症性损伤[8~12]。奥卡西平(OXC是新型抗癫痫药物，本实验通过戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)来建立大鼠癫痫模型，同时通过检测MMP-9与MMP-2的表达情况。发现正常组MMP-9与MMP-2的表达低，注射戊四氮后MMP-9与MMP-2明显上调，而奥卡西平能够下调这种表达，间接为癫痫机制的阐明提供理论依据。

1材料和方法

1.1实验动物分组

220～250g SD品系大鼠(SPF级，大连医科大学实验动物中心提供)，实验条件为室温，正常昼夜更替，24h供应食水。

1.2主要试剂

MMP-2 (72kD,66kD) 单克隆兔抗体，MMP-9 (92kD,82kD,78kD) 单克隆兔抗体，PCR提取及逆转录试剂盒试剂盒等。

1.3制备模型、分组给药方案及行为学观察

220～250g SD品系大鼠40只，随机分成5组，每组8只。称取戊四氮(PTZ)1g,加入生理盐水100mL,溶解，按照35mg/kg标准分别给戊四氮组以及不同浓度奥卡西平组注射，而正常组只注射等量的生理盐水。按照 Racine分级，对照组以及不同浓度奥卡西平组达到三级以上癫痫发作三次，视为戊四氮点燃成功，点燃成功后戊四氮隔日一次相同剂量，用来维持癫痫效应。奥卡西平组按照高剂量(200mg/kg)、中剂量组(100mg/kg)、低剂量组(50mg/kg)一日两次灌胃。时间一共3周。戊四氮组及奥卡西平药物组无死亡。

Racine 分级法：0 级：无任何反应；1 级：胡须抖动，面肌抽动；2 级：点头、咀嚼或湿狗样抖动；3 级：一侧前肢抬起，阵挛；4 级：站立伴有双侧前肢阵挛；5 级：跌倒，全身强直阵挛性发作，或抽搐致死。

实验结束后， 全部大鼠通过断头处理， 用铡刀迅速切取大鼠头部， 将头脑放置冰上， 用咬骨钳拨快速开颅骨， 从中取出全部的脑组织， 以备后续实验。

1.4RT-PCR检测

组织内总RNA的提取，逆转录合成cDNA ，然后PCR扩增经同源比对后确定引物序列，MxPro-Mx3000P软件分析，对PCR的结果进行处理。

1.5统计学方法

2结果

2.1奥卡西平对大鼠行为学变化的影响

实验中我们观察到戊四氮组大鼠有明显的癫痫发作，表现出前肢震颤等行为学障碍，在大鼠疲劳仪(Rota-Rod)上的停留时间显著减少(图1,A，***表示P<0.01)，给予50mg/kg奥卡西平即能够得到一定的改善，随着奥氮平给药剂量的增加，停留时间逐渐增加(#、##、###均表示与戊四氮组的比较)，当奥卡西平达到200mg/kg时，大鼠在疲劳仪上的停留时间与正常对照组一样(N.S.表示无统计学意义)，说明奥卡西平就能够显著改善行为学障碍，大幅度的减少癫痫的发作次数和每次发作的持续时间。并且呈现剂量相关性。各组大鼠体重(图2)没有明显的变化,说明奥卡西平不会影响体重，副作用较小，具有使用价值。

图1　大鼠疲劳仪(Rota-Rod)上的停留时间

图2　大鼠体重变化

图3　不同组大鼠组织中MMP-2,MMP-9的mRNA水平表达

2.2RT-PCR结果

发现正常对照组MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白水平的表达量很低，戊四氮作用组显著升高(P<0.01，P<0.01)，应用奥卡西平治疗后降低，接近正常对照组水平(图3)。

3讨论

MMP-2与MMP-9主要分布于人体的神经组织中，参与了神经元的黏附与识别、轴突、树突的分支与生长以及形成神经元环路的过程，它们在脑损伤后的突触重建和轴突再生过程中发挥了重要作用。同时近年来有许多研宄表明基质金属蛋白酶家族参与癫痫的发生，在发生癫痫时，体内会过度上调MMP-2与MMP-9的表达，可能就会导致异常的神经元的形成，继而此异常神经元发生异常放电。有研究表明，发育中的大脑拮抗癫痫发作所致的突触重建，发育中大脑有一种自我保护机制[13，14]奥卡西平(OXC)是新型抗癫痫药物，它的机制可能是下调MMP-9与MMP-2的表达，从而导致星形胶质细胞的活化被抑制，神经元细胞的坏死以及重建异位突触，从而减轻大脑损伤，由PTZ慢性致癫痫造成的。而MMP-9与MMP-2具体关系有待进一步研究。这种神经保护作用奥卡西平在一定程度与剂量具有线性相关性，大剂量使用OXC可能会影响幼鼠生长。因此，我们需要更加准确的寻找最佳的安全剂量。在临床上应该积极寻找最佳剂量。RT-PCR结果表明正常组的MMP-9与MMP-2的mRNA与蛋白表达水平都处于较低的水平，当注射戊四氮后，MMP-2与MMP-9明显上调(P<0.01，P<0.01)，当灌注不同剂量的奥卡西平之后，MMP-9与MMP-2的表达明显下调，200mg/kg奥卡西平组已接近正常组水平。奥卡西平通过对脑组织内MMP-2、MMP-9表达的干预改善戊四氮致癫大鼠脑的结构和功能，并且具有剂量相关性。

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The effects of oxcarbazapin on expressions of MMP-2,MMP-9 in chronic epilepsy rats induced by pentylenetetrazole

MENGSheng-nan,JINYu-ling

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003,China)

Abstract:Objective: To Study MMP-2 and MMP-9 expression in the brain tissue by establishing epileptic rat model using oxcarbazepine (oxcarbazepine, OXC).Methods: The subjects with SD male rats (SPF grade) were randomly divided into normal group, pentylenetetrazol pentylenetetrazol epileptic group and low concentration oxcarbazepine group. Normal saline group were given pentylenetetrazole 35mg/kg dose level. Pentylenetetrazole group were given pentylenetetrazole 35mg/kg dose level, and concentration oxcarbazepine group were given oxcarbazepine the dose of 200mg / kg, the dose of 100mg / kg, the low-dose group 50mg / kg. The residence time on the case and the fatigue behavior of rats instrument rats were recorded. MMP-2, MMP-9 mRNA and protein expression differences in content between the groups were analyzed by real-time PCR .Results:Epileptic rat model was established by using oxcarbazepine (oxcarbazepine, OXC). MMP-2 and MMP-9 expression were significantly upregulated in three weeks. Body weight and food intake of rats in each group did not change significantly. MMP-2, MMP-9 express after the application of oxcarbazepine treatment were reduced to near normal levels in the control group. The brain structure has been basically removed. RT-PCR results showed that in normal group, MMP-9 mRNA and protein expression levels of MMP-2 were at a low level. MMP-2 and MMP-9 were significantly increased (P < 0.01, P <0.01). With the injection pentylenetetrazol, MMP-9 and MMP-2 expression were significantly reduced. 200mg /kg oxcarbazepine group was close to normal levels with using different doses of oxcarbazepine.Conclusions: MMP-2, MMP-9 expression in the rat brain have a protective effect to brain structure and function by oxcarbazepine intervention with injecting pentylenetetrazol. This protective effect relate to dose.

Key words:oxcarbazapin;chronic epilepsy rat;MMP-2;MMP-9

(收稿日期：2015-04-18)

中图分类号：R742.1

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2016)01-0064-03

作者简介：孟胜男(1985~)女，黑龙江哈尔滨人，在读硕士研究生。通讯作者：金玉玲(1969~)女，黑龙江佳木斯人,硕士，主任医师,硕士研究生导师。E-mail:jyl2017@sina.com。