牵张力对大鼠髁突软骨细胞炎性因子及Hedgehog相关基因的研究①

闫　磊，李善昌，庄亚严，张铁军，赵　亮(佳木斯大学附属口腔医院，黑龙江 佳木斯 154002)



牵张力对大鼠髁突软骨细胞炎性因子及Hedgehog相关基因的研究①

闫磊，李善昌，庄亚严，张铁军，赵亮(佳木斯大学附属口腔医院，黑龙江 佳木斯 154002)

摘要:目的：研究牵张力对大鼠髁突软骨细胞炎性因子及Hedgehog相关基因的影响。方法：体外培育大鼠髁突软骨细胞，将P1代分为对照、低强度以及高强度3组，分别给予0%、3%以及15%的牵张力作用4h，对比三组软骨细胞增殖情况、炎性因子及Hedgehog相关基因的变化。结果：培育48h后，对照组无明显变化，高强度组A450值显著下降，低强度组A450值显著上升；给三组不同程度的牵张力后，三组间IL-1β与TNF-α相差较大，且由对照组到高强度组依次增大，高强度组IL-1β与TNF-α均显著高于对照组与低强度组；低强度组的髁突软骨细胞Hh表达水平均显著高于其他两组，而高强度组Smo的表达显著低于对照组，以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论：Hedgehog基因参与了牵张力对软骨细胞的调控过程，过度的牵张力会抑制软骨细胞的增殖，诱发炎症反应。适度的牵张力能够刺激软骨细胞，促进软骨细胞的增殖。

关键词:牵张力；鼠髁突软骨细胞；炎性因子；相关性

颞下颌关节是人体颌面部唯一的左右双侧联动关节，具有一定的稳定性和多方向的活动性[1]。下颌在产生咀嚼、吞咽以及语言等功能时需要的生物力学负荷通常由髁突软骨负担。此外，下颌骨的生长方向及生长长度也会受到髁突软骨的影响[2]。Hedgehog(Hh)是能够编码一系列分泌蛋白的分节极性基因。有研究报道表明[3]，Hh通路参与牵张力对软骨细胞的调控过程的可能性十分大。但目前国内对软骨细胞调控相关研究较少。本文研究牵张力对大鼠髁突软骨细胞炎性因子及Hedgehog相关基因的影响，以期发现牵引力对颞下颌关节的作用机制。现报道如下。

1材料和方法

1.1试验动物

Sprague-Dawley(SD)老鼠，雌雄不限，鼠龄为两周。

1.2研究方法

1.2.1大鼠髁突软骨的原代培养：在无菌条件下解剖分离大鼠双侧下颌髁突软骨，剥离去除髁突表面的纤维组织后剪取髁突软骨，将其剪碎成约1mm3。移入离心管，0.25%胰蛋白酶、37℃消化30min，0.2%胶原酶Ⅱ、37℃消化4h后，200目滤网过滤收集细胞，0.25%锥虫蓝染色，活细胞率大于90%则用含10%FBS(胎牛血清)的DMEM培养基，在37℃、5%CO2培养箱中孵育，隔天换液，待细胞融合至90%时，胰酶消化，传代培养，记为P1代细胞。

1.2.2大鼠髁突软骨的鉴定：将P1代软骨细胞接种于预先放好爬片的24孔培养板中，培养3d后光镜下观察细胞生长状态，4%多聚甲醛固定后，行甲苯胺蓝染色实验。

1.2.3细胞加力：取P1代软骨细胞分为3组，接种于Flexcell加力板中，每组3个副孔。待细胞融合至80%时，更换为无FBS的培养基培养24h，使各组细胞状态同步化后，再更换为含10%FBS的DMEM培养基继续培养。按加力板使用说明，分别对3组细胞施加0.5Hz，0%(对照组)、3%(低强度组)和15%(高强度组)的牵张应变，作用时间为4h。

1.2.4细胞增殖检测：加力结束后，每组细胞继续培养48 h，加入10μL CCK-8溶液，孵育4 h，测定450 nm处的吸光度值(A450)，重复3次，取平均值进行统计分析。

1.2.5Hedgehog相关基因及细胞炎性因子的检测：提取RNA和反转录加力结束后，收集各组细胞，TRIzol法提取细胞总RNA，反转录成cDNA，置-80℃冰箱保存备用。以cDNA为模板，两步法进行Real-time PCR反应。PCR产物中分别检测细胞炎性因子IL-1β、TNF-α，Hedgehog信号通路分子Ihh、Ptc及Smo的基因表达变化。

1.3统计学方法

采用SPSS13.0软件分析。数据比较以χ2检验，计量数据比较以t检验，相关性分析选用Spearman法。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同程度的牵张力对髁突软骨细胞增殖能力的影响

培育48h后，对照组无明显变化，高强度组A450值显著下降，低强度组A450值显著上升，三组间差异较大，且差异均具有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1　不同程度的牵张力对髁突软骨细胞

注：t为组内完成细胞加力后与培育48h后对比，F值为三组间相互对比，*P<0.05。

2.2不同程度牵张力对髁突软骨细胞炎性因子表达的影响

给三组不同程度的牵张力后，三组间IL-1β与TNF-α相差较大，且由对照组到高强度组依次增大，高强度组IL-1β与TNF-α均显著高于对照组与低强度组，以上差异均具有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2不同程度牵张力对髁突软骨细胞炎性

因子表达的影响

注：F值为三组间相互对比，*P<0.05。

2.3不同程度牵张力对髁突软骨细胞Hedgehog通路基因表达的影响

给三组不同程度的牵张力后，低强度组的髁突软骨细胞Hh表达水平均显著高于其他两组，而高强度组Smo的表达显著低于对照组，以上差异均具有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

表3　不同程度牵张力对髁突软骨细胞Hedgehog

注：F值为三组间相互对比，*P<0.05。

3讨论

有相关报道表明[4]，对软骨细胞给予适合的力学刺激能够促进软骨细胞的生长、分化。但力学刺激程度如果较弱甚至没有，或者过强，则会对软骨细胞的生长代谢产生较大的抑制作用，导致细胞外基质含量平衡遭到破坏，引起关节软骨发生退行性病变。Hedgehog基因是一种分节极性基因，参与了力学刺激对软骨细胞的调控。

本文研究结果显示，对三组髁突软骨细胞进行不同程度的牵张力后，各组A450值相差不大，但在培育48h后，对照组无明显变化，而高强度组A450值显著下降且远低于对照组，低强度组A450值显著上升且远高于对照组。这提示在牵张力大小为3%作用4h后，软骨细胞会在接下来的两天内大量增殖，而若牵引大小为15%则软骨细胞的增殖会受到很大的抑制。给三组不同程度的牵张力后，三组间IL-1β与TNF-α相差较大，且由对照组到高强度组依次增大，给予15%牵张力的高强度组IL-1β与TNF-α均显著高于对照组与低强度组。这表明高强度的力学刺激能够诱导软骨细胞的炎症反应，而低强度的效果不明显。

俞云飞等[5]的研究中表示，牵张力能够刺激下颌骨髁突增殖层软骨细胞Hh家族基因表达，从而影响细胞增殖。这与本研究关于不同程度牵张力对髁突软骨细胞Hedgehog通路基因表达影响的结果相同。给三组不同程度的牵张力后，低强度组的髁突软骨细胞Hh表达水平均显著高于其他两组，而高强度组Smo的表达显著低于对照组。这提示Hh基因家族对力学刺激十分敏感。Hh信号传递受靶细胞膜上两种受体分别为Ptc和Smo的控制。受体Ptc有肿瘤抑制基因Patched编码，是有12个跨膜区的单一肽链构成，能与配体直接结合，对Hh信号起到负调节作用。综上所述，Hedgehog基因参与了牵张力对软骨细胞的调控过程，过度的牵张力会抑制软骨细胞的增殖，诱发炎症反应。而适度的牵张力能够刺激软骨细胞，促进软骨细胞的增殖。

参考文献：

[1]黄圣运，李文刚，张世周，等.微血管吻合器在口腔颌面部缺损重建中的应用[J].中华显微外科杂志，2015,38(4)：389-391

[2]董瑞，王旭霞，张文娟，等.前牵引颏部反作用力对颞下颌关节影响的三维有限元分析[J].中华口腔医学杂志，2013,48(12)：740-744

[3]巫云霞，王林，张卫兵，等.扩张力作用下大鼠腭中缝组织成骨现象的连续观察[J].口腔医学研究，2010，26(3)：309-311

[4]白明海，吴汉江.牵张力与雌激素对兔鼻软骨细胞增殖效应调节的初步研究[J].口腔医学研究，2009，25(4)：412-415

[5]俞云飞，徐宏光，宋俊兴，等.力学刺激对软骨细胞影响研究进展[J].国际骨科学杂志，2012，33(5)：297-299

(收稿日期：2015-01-16)

中图分类号：R782.6

文献标识码:A

文章编号：1008-0104(2016)01-0006-02

作者简介：闫磊(1980～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，主治医师。通讯作者：赵亮(1981～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主治医师。E-mail:28789079@qq.com

基金项目：①黑龙江省卫生计生委科研课题，编号：2014-257。