CyclinB1、HPV16蛋白在宫颈组织芯片中的表达及临床意义

郑　健　王　琨

(内蒙古医科大学附属医院妇产科，内蒙古　呼和浩特　010050)



CyclinB1、HPV16蛋白在宫颈组织芯片中的表达及临床意义

郑健王琨

(内蒙古医科大学附属医院妇产科，内蒙古呼和浩特010050)

〔摘要〕目的探讨细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)和人乳头瘤病毒16(HPV16)型蛋白在宫颈癌变过程中的表达及临床意义。方法采用免疫组化卵白素-生物素-过氧化物酶连接(ABC)法检测二者在不同病变宫颈组织芯片(TMA)中的表达。结果Cyclin B1、HPV16在宫颈癌中表达高于正常宫颈(P<0.05)。Cyclin B1表达在中分化癌组高于高分化癌组及HPV16表达在鳞癌组高于腺癌组(P<0.05)。Cyclin B1与HPV16表达呈正相关(r=0.46，P<0.01)。结论HPV16感染可能是导致宫颈癌中Cyclin B1表达上调的原因之一。二者协同促进宫颈癌的发生。

〔关键词〕细胞周期蛋白B1；人乳头瘤病毒16型蛋白；宫颈癌；组织芯片；免疫组织化学

高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是导致宫颈癌发生的必要因素〔1〕，尤以HPV 16型最常见。尽管通过宫颈液基细胞学检查和HPV相关检测使宫颈癌及早发现而死亡率明显下降，但仍有必要进一步研究其发病机制和演变过程以指导临床治疗。研究发现，细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)是细胞周期 G2/M检测点的正性调控因子，其异常表达与细胞异常增生和一些肿瘤的发生有关〔2〕，其是否与宫颈癌发生有关及其与HPV16的关系如何国内外少有文献报道。本实验应用组织芯片(TMA)结合免疫组化卵白素-生物素-过氧化物酶连接(ABC)法检测Cyclin B1和HPV16在正常宫颈上皮、慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)和浸润癌中的表达及相关性。

1材料与方法

1.1研究对象收集2007年1月至2012年1月我院手术切除和活检的宫颈组织标本172例,其中经病理确诊的正常宫颈上皮27例，慢性宫颈炎42例，CIN 13例，浸润癌90例。术前均未接受任何辅助治疗。其中宫颈癌患者的年龄30~80(平均52)岁。按照1995年国际妇产科联盟颁布的分期标准进行临床分期：Ⅰ期62例，Ⅱ期21例(均为Ⅱa期)，Ⅰ期、Ⅱ期中盆腔淋巴结转移3例，Ⅲ期7例。其中80例鳞癌中高分化24例，中分化47例，低分化9例；10例腺癌中高分化1例，中分化9例。13例CIN中CINⅠ5例、CINⅡ3例、CINⅢ5例。

1.2研究方法所有标本经石蜡包埋、切片、HE染色，然后对照HE切片在蜡块上选定所需的位置，用组织阵列仪抽取组织条作成厚4 μm的连续切片进行免疫组化ABC法染色。鼠抗人Cyclin B1及鼠抗病毒HPV16单克隆抗体和ABC法试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。染色步骤按试剂盒说明严格进行。用磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。由两位病理科医师采用双盲法进行观察。

1.3结果判定Cyclin B1和HPV16的阳性表达定位于细胞质，均呈棕黄色颗粒物。每张切片随机观察5个高倍视野，每个视野计数100个肿瘤细胞。根据染色强度和染色细胞百分率进行评分：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分，同样物镜下阳性细胞百分率≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分，两类分数乘积小于3分为-，满3分为+，4分为，5分以上为。

1.4统计学方法应用SAS9.0软件行χ2检验及Pearson相关分析。

2结果

2.1组织芯片结果排除制备组织芯片时有1例未取到宫颈鳞癌组织和染色脱片因素，最终两张芯片可供分析的例数：Cyclin B1为112例，其中正常宫颈上皮6例，慢性宫颈炎30例，CIN 7例，浸润癌69例(Ⅰ期48例，Ⅱ期17例，均为Ⅱa期，Ⅲ期4例，盆腔淋巴结转移3例。64例鳞癌和5例腺癌，其中高分化19例，中分化44例，低分化6例，年龄>50岁34例，≤50岁35例)。HPV16为119例，其中正常宫颈上皮24例，慢性宫颈炎22例，CIN 4例，浸润癌69例(Ⅰ期46例，Ⅱ期17例，均为Ⅱa期，Ⅲ期6例，盆腔淋巴结转移3例。63例鳞癌和6例腺癌，其中高分化20例，中分化43例，低分化6例，年龄>50岁32例，≤50岁37例)。

2.2Cyclin B1和HPV16在宫颈组织中的表达Cyclin B1的阳性表达定位于细胞质。在正常宫颈和宫颈炎中阳性细胞数量少，在CIN中阳性细胞数增多，着色加深，宫颈癌中阳性细胞数量明显增加，着色明显增强。在宫颈癌中的阳性表达率显著高于正常宫颈和宫颈炎(P<0.05)。在CIN中的阳性表达率较宫颈炎中也显著增高(P<0.05)。而在其余各组间阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。HPV16的阳性表达呈棕黄色，位于细胞质，呈弥漫分布。在宫颈炎、CIN和宫颈癌中的阳性表达率明显高于正常宫颈(P<0.05)，而在其余各组间阳性表达率比较(P>0.05)。见表1，图1，图2。

2.3Cyclin B1和HPV16的表达与宫颈癌临床病理因素的关系宫颈癌组织中Cyclin B1阳性表达与组织分化程度有关。在中、低分化癌中表达阳性率明显高于高分化癌，其中高分化癌与中分化癌组之间阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05)。而其阳性表达与年龄、临床分期、病理类型及淋巴结转移等无关(P>0.05)。HPV16表达与病理类型有关，鳞癌中阳性表达率显著高于腺癌(P<0.05)。而与年龄、临床分期、组织分化程度、淋巴结转移等因素无关(P>0.05)。见表2。

表1　不同病变宫颈组织中Cyclin B1、

与宫颈炎比较：1)P<0.05；与正常宫颈比较：2)P<0.05

2.4Cyclin B1和HPV16在宫颈癌组织中表达的相关性对两张芯片共有的58例宫颈癌组织中两种蛋白表达行Pearson相关分析：Cyclin B1与HPV16呈明显正相关(r=0.46,P<0.01)。

表2　Cyclin B1、HPV16蛋白表达与宫颈癌

与高分化比较：1)P<0.05

图1　Cyclin B1在宫颈癌中表达(ABC,×200)

图2　HPV16在宫颈癌中表达(ABC,×200)

3讨论

细胞周期是通过G1/S,G2/M两个检测点进行调控的。两检测点失控使本来应停止增殖或生理性凋亡的 DNA受到损伤或 DNA复制发生错误的细胞不停地进入细胞周期,因而造成恶性增生〔3〕。研究发现Cyclin B1是细胞周期G2/M检测点的正性调节因子，也是宫颈癌中的重要调控分子〔4〕，由于其主要合成于S期和G2期，因而其增多可促使细胞不断地进入S期和G2期进行DNA复制，导致细胞过度增殖而癌变。另一方面，由于Cyclin B1在G2/M期表达最高,其过度表达使细胞周期G2/M转换时间缩短，进而促进细胞周期的进程，促发癌细胞克服细胞周期G2/M期控节制点进入M期,促进肿瘤的发生与发展〔4〕。本研究发现,随宫颈病变程度加重,Cyclin B1蛋白阳性表达率呈升高的趋势。与徐咏莲等〔5〕的研究结论一致，提示Cyclin B1表达上调在宫颈癌变过程中发挥重要作用，可能是评价宫颈癌变的参考指标。本研究中其在宫颈癌的阳性表达率为71.0%,低于陈丽珍等〔6〕报道的88%，而高于宋敬等〔7〕报道的52.63%。本文提示Cyclin B1异常表达可能宫颈癌发生中的早期事件，这是有助于宫颈癌的早期诊断。这与樊素珍等〔8〕在卵巢癌中得出的结论相似。本研究说明Cyclin B1表达与分化程度有关,分化越低,表达越强，这也与陈丽珍等〔6〕的研究结论一致。

HPV是小型双链环状DNA病毒,目前已发现100多型。其中高危型HPV16/18是宫颈癌的重要致病因素。HPV高危型病毒能使宫颈细胞产生变异，其E6和E7蛋白通过与Rb蛋白作用，促进细胞增殖，而E6蛋白能对抗p53的基因修复功能，使宫颈细胞发展为癌前病变〔9〕。本研究中HPV16蛋白在宫颈癌的阳性表达率为85.5%,高于邢军等〔10〕报道的 75%。这可能与检测标本均为已标记的典型病变区域有关。本文结果表明HPV16感染的累积是引起细胞的转化导致宫颈癌发生的一个重要因素，提示HPV16参与宫颈癌的发生并起重要作用。对HPV16的检测有助于宫颈癌筛查诊断。本研究还发现HPV16蛋白在宫颈鳞癌中较腺癌中阳性表达率高。与李惠新等〔11〕研究认为的HPV16主要导致宫颈鳞癌发生结论一致。也与李宏等〔12〕研究认为的HPV16为宫颈鳞癌主导感染亚型,HPV18为宫颈腺癌主要感染亚型的结论一致。此外,本研究HPV16感染与宫颈癌的年龄、临床分期、组织分化及淋巴结转移无关，提示HPV16持续感染只是导致宫颈癌变的一个主要因素,感染后可引起一系列其他基因的改变而促进宫颈癌的发展进程。

HPV是宫颈癌的主要致病因素,但不是唯一致病因素。HPV对细胞的致癌作用需要一个漫长的积累过程,这种积累可能是细胞同时受其他因子损伤的积累过程,也可能是细胞分裂过程中错误事件的积累。HPV感染的细胞发生恶变需要其他因子的协同作用。本研究显示HPV16与Cyclin B1表达存在正相关，HPV16感染可能是导致Cyclin B1表达上调的原因之一。由于Cyclin B1是细胞周期G2/M检测点的正性调节因子，HPV16感染后,其E1、E4蛋白可能通过上调Cyclin B1表达，促使细胞不断地进入G2期进行DNA复制，导致宫颈上皮细胞异常复制、过度增殖而癌变。这已在Davy等〔13〕的研究中得到证实。因此认为，本研究认为，HPV16与Cyclin B1在宫颈癌变中起协同作用。这与Cho等〔14〕用免疫组化和PCR方法研究认为的Cyclin B1表达与HPV16感染相关的结论一致。

综上，Cyclin B1和HPV16在宫颈癌中的异常表达说明二者均参与了宫颈上皮细胞的癌变。HPV16的持续感染可能是宫颈癌变的起因，而Cyclin B1高表达则通过加快细胞周期的进程而促进具有癌变潜能的细胞被锁定在细胞周期中不断地进行DNA的异常复制、增殖。二者在宫颈癌变的不同阶段扮演者不同的角色，协同促进宫颈癌的发生。

4参考文献

1林川，杨君，李成志.HPV感染对女性心理健康影响的研究进展〔J〕.重庆医学,2013；42(1):75-7.

2Kuhling H,Alm P,Olsson H，etal.Expression of cyclins E,A,and B,and prognosis in lymph node-negative breast cancer〔J〕.J Pathol,2003；199(4):424-31.

3Hartwell LH,Kastan MB.Cell cycle control and cancer〔J〕.Science，1994；266(5192):1821-8.

4赵旻，伍欣星.p34cdc2和cyclin B1在宫颈癌中的表达及临床意义〔J〕.肿瘤，2008；28(11)：959-63.

5徐咏莲，刘少阳，江大琼.宫颈癌中survivin、ki67、cyclinB1的表达及临床意义〔J〕.现代妇产科进展,2004;13(3):184-6.

6陈丽珍，史惠蓉.宫颈癌组织中Cyclin B1和CDC25B的表达及意义〔J〕.山东医药,2008;48(43):93-4.

7宋敬，李越，王秋艳.周期蛋白D1,B1在子宫颈癌中的表达及其与临床病理间的关系〔J〕.中国临床保健杂志，2011;14(5)：469-71，561.

8樊素珍,姚丽,程劼.卵巢上皮性癌组织中细胞周期素B1和CDK1的表达〔J〕.郑州大学学报(医学版),2012;47(4):527-30.

9Martin CM,Astbury K,O'Leary JJ.Molecular profiling of cervical neoplasia〔J〕.Expert Rev Mol Diagn,2006;6(2):217-29.

10邢军，岳天孚，李秀伟，等.宫颈病变中HDACI的表达以及与HPV16感染的关系〔J〕.中国妇幼保健，2011;26(8)：1217-9.

11李惠新，雷静.HPV16E6的表达与宫颈鳞癌发病的相关性研究〔J〕.医学综述，2011;17(16):2507-8.

12李宏，张留苗.人乳头瘤病毒感染亚型与宫颈肿瘤关系的临床分析〔J〕.中国妇幼保健，2012;27(14)：2105-7.

13Davy CE，Jackson DJ，Raj K，etal.Human papillomavirus type 16 E1 E4-induced G2 arrest is associated with cytoplasmic retention of active Cdk1/cyclin B1 complexes〔J〕.J Virol,2005;79(7):3998-4011.

14Cho NH,Lim SY,Kim YT,etal.G2 checkpoint in uterine cervical cancer with HPV 16 E6 according to p53 polymorphism and its screening value〔J〕.Gynecol Oncol,2003;90(1):15-22.

〔2014-07-12修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

〔中图分类号〕R737.33

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)05-1050-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.012

第一作者：郑健(1973-)，男，硕士，副主任医师，硕士生导师，主要从事妇科肿瘤研究。