变应性接触性皮炎的免疫机制

魏若尧，赵作涛，陈天成，刁　颖，李　挚，高　虹，孙劲旅

(中国医学科学院 北京协和医学院 医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心， 北京 100021)

ChinJAllergyClinImmunol，2016，10(3)：255- 263

变应性接触性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)是由半抗原-特应性T细胞介导、于过敏原接触皮肤后激发产生的迟发型超敏反应(Ⅳ型超敏反应)，以抗原刺激后局部皮肤出现一系列的皮肤炎症细胞浸润、炎症介质释放为主要特征[1]。ACD是目前世界上职业性皮肤病的最大难题之一，据统计约占职业性疾病发病率的20%[2]，这种职业性的接触性过敏不仅存在于产业工人中，也常见于医护人员、银行职员中[3]，在中国ACD的发病率也呈逐年上升趋势[4]。目前，关于ACD的分子机制和细胞通路研究多基于动物模型的接触性超敏反应(contact hypersen-sitivity，CHS)，并已有许多文献报道，也为找到ACD有效的治疗手段奠定基础。本文将近年来关于CHS的研究中，参与致敏阶段与激发阶段反应的细胞及分子进行综述(图1)。

致敏阶段

半抗原

CHS是从皮肤与半抗原的第一次接触开始的。半抗原是一种小分子量(相对分子质量<1 000)的化合物，常用于动物模型的半抗原有二硝基氟苯(dinitrofluoroben-zene，DNFB)、恶唑酮、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)和硝基氯代苯(Trinitrochloro-benzene，TNCB)等。几乎所有的半抗原都是亲电子分子，因其小体积和亲脂性的特点，可以渗入皮肤并与皮肤蛋白的亲核残基共价结合。半抗原的共同特点为：自身不具有免疫原性，但通过与蛋白质结合从而获得免疫原性[5]。除此之外半抗原还具有促炎症特点，即可活化皮肤的固有免疫反应，调节朗格汉斯细胞(Langerhans cells，LCs)和真皮内树突状细胞(dermal dendritic cells，dDCs)的募集，迁移和成熟[6- 7]。

抗原提呈细胞

皮肤在稳态时，至少有三种亚型的树突状细胞(dendritic cells，DCs)存在：LCs、CD103+dDCs、CD103-dDCs[8- 10]。LCs主要存在于表皮中，并且是皮肤中数量最多的DCs。CD103-dDCs约占dDCs的80%，CD103+dDCs约占10%[8- 10]。

LCs 长久以来一直被认为是在CHS致敏阶段起关键作用的抗原呈递细胞，并诱导1型辅助性T细胞(Th1细胞)/1型细胞毒性T细胞(Tc1细胞)产生。

图1CHS参与细胞与分步反应示意图

Fig1Illustration of the sensitization and elicitation phase of CHS

CHS：接触性超敏反应

原因在于：(1)LCs在体外具有有效的抗原提呈能力；(2)LCs在表皮中为含量最多的DCs；(3)通过人工使用药物移除皮肤中的LCs后，CHS反应减轻[11]。但最近有研究表明，在致敏阶段消除LCs不会对CHS反应造成影响。反而，在致敏阶段消除CD103+dDCs则会显著地减轻CHS反应[8,12- 13]。现在通常认为CD103+dDCs是在致敏阶段最为重要的DCs亚型。但是CD103+dDCs也许对于致敏并非必不可少。有研究证明，缺失CD103+dDCs的Batf-/-小鼠，也可以表现出CHS反应[14]。因此，尽管现在 CD103+dDCs被认为是调节CHS致敏阶段的关键性细胞，但最近的研究数据说明也许所有的DCs都具有调节致敏的能力。除了LCs和dDCs，角质细胞(Keratinocytes，KCs)、肥大细胞和巨噬细胞也许也有抗原提呈的作用[15]。

肥大血细胞活化

最初，肥大细胞在CHS中的作用是有争议的。在一些研究中，肥大细胞缺失的小鼠在TNCB引起的CHS中表现出炎症反应减轻[16- 17]。另外一些研究则导致炎症表现恶化[18]。但在这些研究中，都使用C57BL/6-KitW-sh/W-sh或者WBB6F1-Kitw/w-v小鼠模型。这些小鼠不仅表现为肥大细胞缺失，同时也有着许多其他的免疫改变。使其影响肥大细胞在CHS中的作用的研究。

2011年，两个课题组建立了一种新型的肥大细胞缺失小鼠模型[19- 20]。其肥大细胞可以通过白喉毒素的调节有条件的缺失。通过实验，肥大细胞缺失组小鼠均表现为CHS反应减轻[20]。同时，肥大细胞细胞膜上的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)可以通过细胞间黏附分子- 1(intercellular cell adhesion molecule- 1，ICAM- 1)刺激DCs。而活化的DCs则反过来增加肥大细胞的Ca2+的摄入。即肥大细胞可以和DCs相互活化。因此当肥大细胞缺失时，在CHS致敏阶段，皮肤中DCs的迁移和T细胞的活化都发生了削弱从而造成CHS反应减弱。在激发阶段时，由于肥大细胞缺失，组胺分泌量减少从而血管通透性降低也会造成CHS反应减弱[19]。

T细胞活化

T细胞的活化依赖三种信号：(1)第一种信号是T细胞受体(T cell receptor，TCR)和主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)/肽复合体之间的相互作用。半抗原的物理特点造成抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs)对它的处理和提呈通路的不同。一种为半抗原和胞外的细胞表面蛋白结并发内化至胞内，然后被内含体/溶酶体处理为肽段并提呈给Ⅱ型MHC分子，活化CD4+T细胞。半抗原结合的胞外的细胞表面蛋白也会交叉提呈给CD8+T细胞。另一种是因为大多数半抗原具有脂溶性，可以通过被动扩散进入细胞然后与胞内蛋白结合。通过内生途径的处理，与Ⅰ型MHC分子结并发提呈给 CD8+T细胞[21]。(2)第二种信号是APCs上的共刺激分子：CD80 和CD86，它们是在T细胞上表达的CD28分子的配体[22]。这个通路对CHS反应来说是必不可少的，有研究显示CD28缺失的小鼠几乎不表现出任何的CHS反应[23]。在CHS反应中CD86的作用比CD80的作用更加重要，这与CD86在LCs 上的表达量更高有关[22, 24]。(3)第三种信号是促使T细胞分化成为不同亚型的效应细胞的关键。CD4+T细胞的分化主要取决于在APCs和T细胞相互作用时分泌的细胞因子的类型。白细胞介素(interleukin，IL)- 12和γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)存在时，CD4+T细胞分化成为Th1细胞，释放IL- 2和IFN-γ; 在IL- 4作用下，CD4+T细胞分化为2型辅助性T细胞(Th2细胞)，分泌IL- 4、IL- 5和IL- 13[25]。CD8+T细胞分化成为Tc1和2型细胞毒性T细胞(Tc2细胞)所需要的细胞活素与CD4+T细胞相同[26]，并合成相同类型的细胞活素(Tc1分泌IL- 2、IFN-γ和TNF-α，Tc2分泌IL- 4、IL- 5和IL- 10)。

在活化之后，T细胞通过淋巴输出管迁移出淋巴结，进入循环。生成两种亚型的记忆T细胞。效应记忆T细胞(Tem)，不表达趋化因子受体CCR7，可以快速进入炎症器官进行作用。而储存记忆T细胞(Tcm)表达CCR7，具有从血液中再循环至引流淋巴结(draining lymph nodes，dLNs)的能力。当再次暴露于半抗原时可以快速地增殖。抗原特异性T细胞从dLNs迁移出标志着致敏过程的结束(图2)。

与皮肤免疫相关的CD4辅助T细胞(Th细胞)和CD8细胞毒性T细胞(Tc细胞)可以再细分为三个亚型：Th1/Tc1、Th2/Tc2和Th17/Tc17。Th1/Tc1细胞的特点在于分泌IFN-γ，Th2/Tc2细胞分泌IL- 4、IL- 5和IL- 13，同时Th17/Tc17分泌IL- 17A和IL- 22[27]。每种半抗原会具有不同的特点，所以诱导产生的占主导地位的Th/Tc亚型也是不同的，不同的实验鼠品系也会造成不同的结果。我们在解释每种T细胞在接触性皮炎中的作用时，也应该考虑这一点。常用的可以引起接触性皮炎的半抗原包括TNCB、DNFB和FITC。其中TNCB、DNFB通常被认为促进Th1细胞的激活和IFN-γ的释放；FITC则因为邻二苯基的辅助作用促进Th2细胞的激活和IL- 4的释放[28]。

图2T细胞活化示意图

Fig2Activation of the T cell by contact allergens

IL- 17 被报道在致敏阶段和激发阶段都起到了作用[29- 30]。IL- 17也由其他细胞如γδT 细胞和中性粒细胞产生。实验数据证明，在接触性皮炎的激发期，各T细胞亚型的相对重要性取决于实验所使用的模型。与接触性皮炎致敏期和激发期抗原特异性T细胞出现并激活相关的因素可能包括抗原第一次呈递时的微环境(皮肤或其他身体部位；正常皮肤或炎症皮肤)，抗原的类型以及个体的基因背景。模型动物对于动物房设施内存在的微生物所产生的反复的免疫反应，在一定条件下也会影响到T细胞的类型。

激发过程

固有免疫细胞的活化

在激发的起始阶段，中性粒细胞对皮肤的浸润是效应T细胞浸润的前提[17, 31- 32]。效应T细胞在炎症皮肤中的募集和停留只部分地依赖于抗原特异性[33]。因此效应Th1/Tc1细胞可以随着半抗原引起的炎症浸润至皮肤。当半抗原的浓度无法引起这个非抗原特异性的炎症时，CHS反应不会发生[7]。半抗原引起皮肤炎症包括直接的细胞接触和间接的活化Toll样受体(Toll-like receptor，TLRs)和NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)。捕获抗原的皮肤DCs激活效应T细胞，并使之产生细胞因子。细胞因子激发抗原特异性炎症。近来有报道称固有免疫系统中的TLRs和NLRs激活是引起半抗原炎症的重要机制[5, 34- 35]。半抗原与细胞接触引起损伤，致使活性氧类(reactive oxygen species，ROS)生成[36- 37]。ROS降解细胞外基质(如透明质酸)，形成低分子量透明质酸[5]。这样的低分子量透明质酸刺激周边细胞，如DCs、KCs和肥大细胞上表达的 TLR2和TLR4[38- 40]，最终引起核素-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)和蛋白酶分裂原(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)活化，并引起多种促炎细胞因子和趋化因子释放。这些细胞活素和趋化因子驱使DCs迁移至dLNs并引导炎性细胞浸润至皮肤。半抗原同时引起三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的释放。ATP刺激嘌呤能受体P2X7，此受体触发NOD的亮氨酸富集区域受体(leucine rich repeat，LRR)和pyrin 区域(NLR family pyrin domain containing3，NLRP3)，激活KCs中的NLRP3。KCs释放IL- 1β和IL- 18，这两种IL也可以造成皮肤炎症[41- 42]。半抗原也会引起肥大细胞释放组胺，增加血管通透性。总体来说，半抗原引起固有免疫细胞活化，启动了中性粒细胞浸润，然后引起效应T细胞在皮肤中募集(图3)。

图3固有免疫细胞活化过程示意图[43]

Fig3Activation of the innate immune system by contact allergens[43]

白细胞簇状结构形成

在抗原引起的抗原非特异性炎症之后，白细胞簇状结构形成是皮肤中效应T细胞的活化和T细胞调节的抗原特异性炎症形成的必要的一环。T细胞浸润进入皮肤，和携带抗原的DCs形成稳定的相互作用并释放细胞因子[44]。DCs在效应T细胞的活化过程中起到重要的作用[45]。由活化的T细胞产生的细胞因子刺激皮肤中固有细胞，然后进一步引发T细胞的募集和增殖。最近的研究发现皮肤中的白细胞在抗原刺激后形成簇状结构，这个结构对高效地活化皮肤中的效应T细胞十分重要[45]。在皮肤处于正常状态时，皮肤中的DCs是在皮肤中随机分布，积极运动的。但是，在接触半抗原后，DCs在毛细小静脉周围形成簇状结构，效应T细胞也在其四周积累成为簇状结构。若巨噬细胞缺失，则DCs的簇状结构完全无法形成，同时也伴随着在皮肤中效应T细胞活化的削弱，阻断IL- 1或趋化因子2(C-X-C motif chemokine 2，CXCL2)削弱了白细胞簇状结构的形成和效应T细胞的活化。KCs是IL- 1的主要生产者。在两种亚型的巨噬细胞中，经典激活的M1型和选择激活的M2型巨噬细胞，M2型具有显著较高水平的IL- 1受体表达，IL- 1作用于M2型巨噬细胞后，释放CXCL2[45]。这个结果表明，白细胞簇状结构对于皮肤中效应T细胞的活化是必不可少的，IL- 1、CXCL2通过M2型巨噬细胞调节簇状结构形成[45]。

B细胞、自然杀伤T细胞和自然杀伤细胞的活化

最近的研究证实B细胞在CHS中的重要意义，特别是对其亚型B- 1细胞的研究较为详细。有研究表明T细胞在早期补体活化的时候募集并且产生C5a补体片段，C5a受体敲除小鼠在激发2 h和24 h之后，均表现出耳肿胀反应的减轻。说明C5a在CHS的激发阶段中起作用。在致敏后的1 h之内，B- 1细胞被激活，并迁移至脾和淋巴结，产生半抗原特异性的lgM抗体[46]。这些抗体与半抗原结合为免疫复合体从而活化补体。这种补体片段大量生成并合成C5a，然后发起效应T细胞的募集并促成小鼠在24 h后皮肤的反应[47]。体现了在此过程中的B细胞的作用。

尽管 B- 1 细胞的激活不依赖于T细胞，但受到自然杀伤(natural killer，NK)T细胞调节。NKT细胞的对B- 1细胞的激活作用主要依靠在致敏过程中由皮肤释放的胞内脂质。这种脂质和肝脏的APCs结合引起肝脏的NKT细胞释放IL- 4。半抗原蛋白质复合体从致敏部位和IL- 4一同释放，共同活化B- 1细胞[48]。与野生型小鼠相比，B细胞缺失小鼠CHS反应减弱[47]。综上所述，B细胞在CHS反应中确实起到了一定作用。

长期以来NK细胞被认为是固有免疫系统的细胞。但是，最近许多研究显示其有一些亚型具有记忆性。这种特征使NK细胞也成为适应性免疫系统的一部分。有实验利用T细胞和B细胞缺失的小鼠模型，发现NK细胞展现出了对半抗原的抗原特异性免疫记忆。通过进一步研究，发现这种记忆性反应由肝脏NK细胞调控[49- 50]。NK细胞在未来将会在CHS和其他类型的炎症反应中得到更彻底的研究。

调节性T细胞和B细胞

对于接触性皮炎中调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)的调节机制的研究逐渐增多，在激发期之前，外源转移Tregs，会抑制耳肿胀反应。对于这种抑制反应，目前提出的机制有以下几种：(1)Tregs分泌的IL- 10通过下调血管内皮细胞中的E/P选择蛋白的表达，抑制了白细胞进入皮肤[51]。(2)通过腺苷调节机制，Tregs通过大量表达的CD39/73降解ATP，形成腺苷。腺苷抑制白细胞活性，同时也可以通过下调血管内皮细胞中的E/P调节蛋白类抑制白细胞进入皮肤[52]。但是，ATP不仅是生成腺苷的底物，同时也可以作用于Tregs上的P2X7受体，激活Tregs的免疫抑制作用[53]。在接触性皮炎的致敏期移除Tregs同样也可以抑制炎症反应。淋巴结中的Tregs通过ATP激活获得活性显性，活化的Tregs和淋巴结中的DCs结合，造成与激活的CD8 T细胞结合的DCs减少[54]。当致敏期的Tregs被剔除之后，会造成CD4和CD8 T细胞的更高水平的表达，引起增强耳肿胀反应并延长其反应时间。说明内源性Tregs对调控致敏也存在特有的作用[31]。在激发期Tregs被去除时，也造成了耳肿胀的增强和反应时间的延长，证明Tregs对于炎症终止的作用[55]。在炎症过程中，皮肤中的Tregs会显著增加，证明Tregs对炎症部位存在抑制作用。曾有报道称，在正常皮肤中CCR4是对Tregs迁移至皮肤中起关键性作用的受体[56]。但最近有报道称CCR4受体缺失对Tregs向皮肤迁移至炎症激发部位并无显著的抑制作用。因为在激发期的皮肤中CCR4缺失小鼠表现出相同甚至更高水平的Tregs数目[57]。在接触性皮炎发生过程中，其他趋化因子受体(如CCR10)，可能会对CCR4的作用产生代偿。

除了Tregs，调节性B细胞(regulatory B cells，Bregs)被认为是接触性皮炎的过程中存在的另一种调节细胞。Bregs的标志为细胞表面的CD1bCD5+，并分泌大量IL- 10[58- 59]。有1%～2%的脾脏B220+T细胞是Bregs。CD19缺乏小鼠表现出炎症反应增强，将Bregs转移至CD19缺失小鼠体内可以正常化炎症程度[60]。

小结与展望

ACD的炎症反应涉及许多不同的通路和免疫机制，包括大量不同的细胞类型、细胞因子、趋化因子和受体，还涉及局部和系统免疫反应，并同时覆盖了固有免疫系统和自身免疫系统。这使得CHS模型为许多机制的研究提供了合适的研究模型。许多免疫调节剂类药物(如TNF-α抑制剂、IL- 6 拮抗剂、IL- 12抑制剂或CTLA4-Ig拮抗剂)在CHS模型中显示了很好的效果。这些情况说明这种模型可能在抗炎前体药物的体内机制研究上发挥重要作用。但是，关于CHS反应还有许多未知方面需要在未来研究中进一步探索，如：半抗原如何激活固有免疫系统并调节信号激活APCs。此外，第二次的抗原提呈过程中，相关的定位和细胞类型也需要进一步的研究。同时，B细胞、NK细胞、NKT细胞在CHS反应中表现出的作用使得研究更加复杂。而且更多的细胞类型，如KCs、肥大细胞和血小板对CHS反应的重要作用以及未知的受体、通路和递质在未来肯定还会被不断发现。

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