Ro52表达水平下降与系统性红斑狼疮患者B细胞异常激活的相关性

万姝岑，周　炜

(北京大学第一医院风湿免疫科， 北京 100034)

ChinJAllergyClinImmunol，2016，10(3)：219- 224

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种累及多系统的自身免疫性疾病，B细胞过度活化、增殖，产生多种自身抗体是疾病发生的重要机制之一[1]。

Ro52是可提取核抗原(extracted nuclear antigens，ENA)的一种，是抗干燥综合征A针对的自身抗原之一，因在N端含有RING锌指-B盒-卷曲螺旋三个结构域(RING finger domain，B-box domain，coiled coil domain)组成的基序，是三基序(tripartite motif，TRIM)蛋白家族的一员，被称为TRIM21[2- 3]。抗Ro52与皮肤损害和新生儿心脏传导阻滞相关[4- 5]。研究表明Ro52具有E3泛素连接酶活性，并参与细胞增殖的调控[6]。泛素是保守的含有76个氨基酸的小蛋白，真核细胞通过泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)以及泛素连接酶(E3)将泛素连接到特定蛋白质上的过程被称为泛素化，是重要的蛋白翻译后修饰。泛素化不但是细胞内蛋白通过蛋白酶体降解的信号，也是调控蛋白定位与功能的重要机制之一，参与了淋巴细胞的激活、免疫耐受诱导等多种免疫反应过程，泛素连接酶的功能异常可以造成自身免疫性疾病的异常免疫反应[7- 8]。

作为泛素连接酶，Ro52有可能参与免疫反应的调控。在小鼠B细胞系中过度表达Ro52可抑制淋巴细胞增殖，并在CD40激活时增加细胞的凋亡[6]。为进一步探讨Ro52是否参与了SLE患者B淋巴细胞的异常激活，我们通过CD40与B细胞受体信号通路激活SLE患者和健康对照外周血单个核细胞中的B淋巴细胞并检测Ro52表达水平。

材料与方法

对象

选择北京大学第一医院风湿免疫科随访的14例SLE患者，符合美国风湿协会诊断标准[9]，男性1例，女性13例，平均年龄(53±27)岁；10名健康的医务人员作为对照，包括男性1名，女性9名，平均年龄(45±17)岁，与患者年龄差异无统计学意义。本研究得到北京大学第一医院伦理委员会批准，患者签署了知情同意书。

使用淋巴细胞分离液(天津灏洋生物技术公司)通过密度梯度离心分离外周血单个核细胞。在平底96孔板培养新鲜分离的细胞，每孔150 000个细胞，培养基为含5%胎牛血清的RPMI- 1640，其中含青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml，2 nmol/L L-谷氨酰胺。使用抗IgM(Jackson Immuno Research)2.5 μg/ml和0.5 μg/ml+抗CD40(abcam B-B20 ab47021)0.2 μg/ml，抗IgG(Jackson ImmunoResearch)2.5 μg/ml和0.5 μg/ml+抗CD40 0.2 μg/ml刺激B细胞受体诱导B细胞增殖；另外还用美洲商陆有丝分裂原(pokeweed mitogen，PWM)1和0.2 μg/ml以及单独的抗CD40 1和0.2 μg/ml刺激B细胞增殖，培养5 d。

细胞周期测定

细胞周期检测使用碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色流式细胞仪分析。每例患者每个刺激条件收集3个培养孔的细胞，合并后用1 ml PBS洗两次，分出0.2 ml 细胞进行定量PCR。在1 ml 80%预冷乙醇重悬细胞，加入0.5 ml PI/RNase染色液(BD Pharmingen 550825)，4 ℃避光孵育1 h，用PBS洗两次后上流式细胞仪进行细胞周期分析。G1代表细胞处于静止状态，S+G2/M期细胞代表细胞处于增殖状态。

Ro52的定量RT-PCR

培养细胞提取总RNA，通过随机引物法反转录为cDNA，使用SYBR Green PCR Kit(Qiagen)试剂盒，ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(Applied Biosystem)进行定量PCR。Ro52扩增引物，上游5′-GAACTGCTGCAGGAGGTGATAA-3′，下游5′-AGTTCT GGAGAGGTAATATCCAGGTC-3′；GAPDH扩增引物，上游5′-AGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAAA-3′，下游5′-CATATTGGAACATGTAAACCATGTAGTTG-3′[6]。Ro52与内参GAPDH的比值为Ro52的相对表达水平。

统计学处理

结　　果

SLE患者B细胞受刺激后增殖水平与健康对照比较

1.6 疗效标准 临床症候观察项目为：气促、发热、咳嗽。参照卫生部制定的《中药新药临床研究指导原则》和国家中医药管理局制定的《中医病证诊断疗效标准》及相关文献进行检索［5-6］，将主要症状按轻重程度分为4级，以3分制积分：正常为0分，轻度为1分，中度为2分，重度为3分。

细胞周期分析发现，SLE患者外周血单个核细胞未经刺激培养5 d后，S期和G2/M期细胞为3.0%±1.0%，显著高于健康对照的1.8%±0.7%，差异具有统计学意义(P<0.05)。在抗CD40(1 μg/ml)，抗IgM(2.5 μg/ml)+抗CD40(0.2 μg/ml)以及小剂量抗IgG(0.5 μg/ml)+抗CD40(0.2 μg/ml)刺激诱导B细胞活化后，SLE患者细胞培养第5天检测S期和G2/M期细胞分别为3.6%±0.7%，7.9%±2.5%及5.1%±1.3%，显著高于健康对照(2.4%±0.6%，3.7%±1.3%及2.7%±0.5%，P<0.05)(图1)。

SLE患者Ro52表达水平与健康对照比较

SLE患者B细胞激活后增殖水平显著高于对照，相反在未经刺激培养5 d的外周血单个核细胞以及PWM，抗CD40，抗IgM+抗CD40和抗IgG+抗CD40诱导B细胞增殖的细胞中，SLE患者Ro52表达水平均显著低于健康对照(图2)。

Ro52表达水平与B细胞激活后增殖细胞的数量关系

SLE患者与健康对照在B细胞激活后检测Ro52表达水平与增殖细胞数呈现负相关的趋势。将PWM、抗CD40、抗IgM+抗CD40以及抗IgG+抗CD40刺激细胞后S+G2/M细胞百分数与Ro52表达水平呈负相关，相关系数r分别为-0.42，-0.25，-0.49，-0.40，P均<0.05，显示增殖细胞中Ro52表达水平下调(图3)。

图1SLE患者B细胞增殖水平高于对照

Fig1B cell proliferation level of SLE patients was higher than that of healthy controls

经过抗CD40，抗IgM+抗CD40以及抗IgG+抗CD40刺激B细胞增殖后，SLE患者增殖细胞百分比显著高于对照组，*P<0.05

抗CD40激活SLE患者B细胞使Ro52表达下降与健康对照比较

SLE患者与健康对照在B细胞激活后Ro52 表达水平均下降，大剂量(1 μg/ml)抗CD40激活B细胞时，SLE患者较健康对照出现更加显著的Ro52表达下降(0.62±0.1vs. 1.04±0.2，P=0.04)；其他刺激造成B细胞激活后Ro52下降的程度，SLE患者与健康对照差异无统计学意义(图4)。

图2SLE患者Ro52表达水平低于健康对照

Fig2Ro52 expression level of SLE patients was lower than that of healthy controls

SLE患者未经刺激的外周血单个核细胞以及PWM，抗CD40，抗IgM+抗CD40或抗IgG+抗CD40刺激B细胞增殖后，Ro52表达水平显著低于健康对照，均P<0.05

图3Ro52表达水平与B细胞激活后增殖细胞的数量相关性分析

Fig3Correlation analysis of Ro52 expression level and proliferating cell number after B cells were activated

当PWM，抗CD40，抗IgM+抗CD40以及抗IgG+抗CD40刺激B细胞增殖后，增殖细胞百分比(%)与Ro52表达水平呈现负相关的趋势，相关系数分别为-0.42，-0.25，-0.49，-0.40，P<0.05

讨　　论

实验选择使用的抗CD40可以产生类似CD40配体的作用，单独或联合抗IgG/抗IgM激活B细胞受体，可诱导B细胞活化。PWM的特异性稍差，但主要作用是诱导B细胞增殖。本研究发现，SLE患者B细胞激活后增殖细胞数量显著高于健康对照，而在激活的细胞中Ro52表达水平显著低于对照。Ro52表达水平与增殖细胞数量呈负相关，SLE患者的B细胞在CD40被激活后Ro52表达水平的下降程度显著高于健康对照。研究结果提示CD40信号通路活化使Ro52表达下调可能参与了SLE患者B细胞的异常活化。

图4抗CD40激活B细胞后，SLE患者Ro52表达水平的下降显著高于对照

Fig4After B cells were activated by anti-CD40, the expression level of Ro52 in SLE patients decreased more significantly than that of healthy controls

Ro52基因敲除小鼠出现严重皮炎，伴高球蛋白血症和抗核抗体的出现，提示Ro52有重要的免疫调控作用[10]。Ro52在B细胞系A20中过度表达会导致细胞生长变慢并增加细胞凋亡，提示Ro52具有抑制B细胞活化的作用[6]。有研究发现，Ro52依赖E3泛素连接酶活性，通过泛素化途径调控p27与Bcl- 2的活性来调控细胞增殖[11]和凋亡[12]。提示本研究发现的增殖细胞中Ro52表达水平的下调可能是SLE患者B细胞增殖水平增高的调控机制之一。

CD40信号通路的激活在B细胞增殖、分化中发挥重要作用[13- 14]。而CD40信号通路的异常也参与了SLE的发病[15]，也有研究试图抑制CD40信号传导治疗SLE[16]。本研究发现刺激CD40可以在SLE患者B细胞更加显著地抑制Ro52表达，因此CD40激活-Ro52表达下调-B细胞增殖增加，这个调控机制在SLE发病中的作用值得进一步研究。

SLE患者B细胞激活水平显著高于健康对照，Ro52表达水平与B细胞的增殖水平呈负相关，抗CD40激活SLE患者B细胞后Ro52表达下调更加显著，提示Ro52可能参与了SLE 患者B细胞异常激活的调控。Ro52调控SLE患者B细胞异常激活的机制值得进一步研究。

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