人脐带间充质干细胞对难治性免疫性血小板减少症患者B淋巴细胞分化及分泌功能的影响

曾玉晓，徐玲珑，吴迪炯，叶宝东，高雁婷，刘文宾，周郁鸿

(浙江中医药大学第一临床医学院血液科， 杭州 310006)

ChinJAllergyClinImmunol，2016，10(3)：207- 212

免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia，ITP)是免疫介导的血小板过度破坏、巨核细胞数量和质量异常，血小板生成相对不足的自身免疫性疾病。ITP的治疗，目前主要从激素、丙种球蛋白冲击、切脾、化疗等方面着手，取得了一定疗效。对于难治性血小板减少症患者，抗CD20单克隆抗体(美罗华)已成为重要的选择手段之一，但其存在着价格昂贵，远期疗效尚有无法确定的不足。目前，已有采用间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)治疗ITP[1]的个案报道，但相关的实验研究仍相对缺乏。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)来源丰富，增殖分化能力强[2- 3]。因此，本实验探索hUC-MSCs对难治性免疫性血小板减少症(refractory immune thrombocytopenia，rITP)患者外周血B细胞分化及分泌功能的影响。

资料与方法

病例来源

病例资料为2012年6月至2013年10月本院rITP患者26例，男性10例，女性16例，中位年龄44(12～68)岁。健康供者6例，男性4例，女性2例，中位年龄28(21～40)岁。

rITP患者纳入标准

(1)脾切除后无效或复发者或依赖激素者；(2)仍需治疗以降低出血的危险；(3)除外其他引起血小板减少症的原因，确诊ITP。

hUC-MSCs的提取[4]及纯度鉴定

人脐带由浙江省杭州市第一人民医院提供，通过了浙江省中医院伦理委员会伦理批准。将无菌脐带用含有青链霉素双抗的PBS清洗；剥离华通氏胶，将华通氏胶剪碎至约2 mm×2 mm×2 mm大小；用0.2%的Ⅱ型胶原酶，37 ℃消化4～5 h；消化物用50目、200目滤网过滤，过滤液用PBS稀释，分别以2 000 r/min×15 min、1 500 r/min×15 min、800 r/min×5 min离心，弃上清液；计数，细胞以7.5×105个接种于25 cm2培养瓶内，48 h后首次换液，细胞融合度达90%时胰酶消化，以0.5×105/L传代培养。取第三代的hUC-MSCs，用CD44、CD31标记hUC-MSCs用流式细胞仪检测其纯度。

健康供者及rITP患者外周血B细胞的分离及共培养体系的建立

用人外周血淋巴细胞分离液以密度梯度离心法分离出rITP患者及健康供者外周血单个核细胞，调整细胞数为7.5×107/L，用流式细胞仪检测CD19标记的细胞。胰酶消化融合度90%的hUC-MSCs细胞，调节细胞浓度为5×105个接种于培养皿，贴壁3 h后，分别以hUC-MSCs∶单个核细胞0.5∶10、1∶10、2∶10、4∶10、8∶10建立共培养体系。

美洲商陆刺激B细胞分化及酶联免疫吸附测定法检测抗体IgM、IgG分泌量

将浓度分别为30、10、1 mg/L的美洲商陆(Pokeweed，PWM)加入健康供者外周血分离的单个核细胞中培养2、4、7 d，按酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)试剂盒说明书检测标准品及上清液分泌抗体IgM和IgG的吸光度值(OD值)，绘制标准曲线，计算两种抗体的浓度。外周血单个核细胞与hUC-MSCs共培养4 d，收集上清液，按ELISA试剂盒说明书检测标准品及上清液分泌抗体IgM和IgG的OD值，计算两种抗体的浓度。

EnVision免疫组化法测B细胞诱导的成熟蛋白-1的表达

外周血单个核细胞与hUC-MSCs共培养4 d，CD138标记细胞。EnVision二步法免疫组化，检测B细胞诱导的成熟蛋白- 1(B lymphocyte-induced maturation protein1，Blimp- 1)被抑制程度。阳性率(positive rate, PR)=阳性细胞数/(阴性细胞数+阳性细胞数)×100%。

计分标准[5- 6]：(1)阳性强度的判断：按着色细胞染色强弱判断，细胞染色呈阴性为(-)；染色弱，阳性细胞呈淡黄色为(+)；染色中等，阳性细胞呈棕黄色为(++)；染色强，阳性细胞呈棕褐色为(+++)，统计时分别用0、1、2和3分表示。(2) 阳性率的判断：没有阳性细胞的计为(-)，阳性率小于25%的计为(+)，阳性率介于26%～50%之间的计为(++)，阳性率大于50%计为(+++)，统计时分别用0、1、2、3分表示。

统计学处理

结　　果

流式细胞仪检测hUC-MSCs纯度和外周血单个核细胞B细胞比例

流式细胞仪检测第三代hUC-MSCs表面CD44和CD31表达分别为99.8%和1.6%。流式细胞仪检测健康供者、rITP患者外周血单个核细胞CD19标记的细胞分别为6.9%和6.2%(图1、2)。

B细胞分化为浆细胞分泌抗体与PWM浓度和作用时间的相关性

PWM浓度30、10、1 mg/L，作用4 d时健康供者组IgG分泌量分别为(4.83±0.17)、(3.49±0.66)、(2.97±0.88)μg/L，分别高于同浓度第2天、第7天IgG分泌量(P均<0.01)；IgM分泌量分别为(3.47±0.49)、(1.84±0.46)、(1.67±0.65)μg/L，高于同浓度第2天、第7天IgM分泌量(P均<0.01)(图3)，因此以PWM为30 mg/L、4 d作为PWM刺激B细胞的浓度和时间。该刺激条件下rITP患者组IgG分泌量为(7.39±1.42)μg/L，高于健康供者组(P=0.014)；rITP患者组IgM分泌量为(5.44±0.17)μg/L，高于健康供者组(P=0.039)(表1)。选用PWM浓度为30 mg/L，作用时间4 d进行下一步实验。

图1hUC-MSCs纯度鉴定

Fig1hUC-MSCs’ purity identification

hUC-MSCs：人脐带间充质干细胞；CD44标记的hUC-MSCs细胞占99.8%；CD31标记的hUC-MSCs细胞占1.6%

hUC-MSCs抑制抗体IgG、IgM的分泌

hUC-MSCs和rITP患者外周血单个核细胞以2∶10共培养时，rITP患者IgG、IgM分泌量分别是(4.98±1.63)和(3.78±0.82)μg/L，明显低于无hUC-MSCs时IgG、IgM分泌量(P=0.005、0.003)。此比例时rITP患者组IgG、IgM分泌量和健康供者组无明显差异(P=0.266、0.543)(表2)。

hUC-MSCs抑制Blimp- 1蛋白的表达

rITP患者CD138标记细胞阳性率即Blimp- 1蛋白表达率在hUC-MSCs∶单个核细胞为2∶10时为33.51%，较无hUC-MSCs时明显下降(P=0.026)，与健康供者组比差异无统计学意义(P=0.076)(图4)。

图2外周血CD19标记的细胞百分比

Fig2CD19 marked peripheral blood mononuclear cells

rITP：难治性免疫性血小板减少症；健康供者组外周血CD19标记细胞为6.9%； rITP患者组外周血CD19标记细胞为6.2%

图3健康供者外周血在不同PWM浓度及不同作用时间时IgG、IgM分泌量

Fig3IgG and IgM secretion levels of healthy donors with different PWM concentration and work time

PWM：美洲商陆

表1不同PWM浓度时健康供者组及rITP患者组IgG、IgM的分泌量
Table1IgG and IgM secretion levels of healthy donors and rITP patients with different PWM concentration

PWM(mg/L)健康供者rITP患者IgGIgMIgGIgM　1　　　297±088△　　　167±065△　　　465±087△　　　276±112△10　　　349±066#　　　184±046△　　　497±067△　　　259±053△30　　　483±017　　　347±049　　　739±142∗　　　544±017∗

PWM：美洲商陆；rITP：难治性免疫性血小板减少症；与健康供者比较，*P<0.01；与PWM 30 mg/L比较，#P<0.05，△P<0.01

表2rITP患者外周血单个核细胞与hUC-MSCs不同比例及无hUC-MSCs时IgG、IgM分泌量
Table2IgG and IgM secretion levels of rITP patients with no-hUC-MSCs and PBMCs co-cultured with hUC-MSCs in different ratio

hUC⁃MSCs：PBMCIgGIgM无hUC⁃MSCs　　739±142　　544±01705∶10　　724±144　　564±0961∶10　　670±061　　528±1052∶10　　498±163∗　　378±082∗4∶10　　680±187　　533±0708∶10　　707±112　　603±116

rITP：难治性免疫性血小板减少症；hUC-MSCs：人脐带间充质干细胞；PBMC:外周血单个核细胞；与无hUC-MSCs比较，*P<0.01

图4　健康供者组、rITP患者组无hUC-MSCs、外周血单个核细胞与hUC-MSCs不同比例时Blimp- 1蛋白表达率Fig 4　Blimp- 1 protein expression of healthy donors,no-hUC-MSCs and PBMCs co-cultured with hUC-MSCs in different ratio of rITP patientsrITP：难治性免疫性血小板减少症；hUC-MSCs：人脐带间充质干细胞；Blimp- 1：B细胞诱导的成熟蛋白- 1; PBMC：外周血单个核细胞

讨　　论

MSCs是全能干细胞，可以从骨髓、脐带、脂肪等组织中提取，有自我更新、分化的能力。有易于分离提取、特异性表面标记、可分化为多种细胞具有免疫调节、迁移等特性，因此MSCs可用于治疗再生障碍性贫血、系统性红斑狼疮、糖尿病、多发性硬化症等自身免疫性疾病。MSCs具有调节T细胞、B细胞、单核巨噬细胞等免疫细胞的功能[7]。目前认为MSCs通过可溶性因子[8]、白细胞介素10(interleukin- 10, IL- 10)、转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)[9]、γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)等调节T细胞的活化增殖。MSCs使B 细胞停滞在G0/G1期、改变B细胞胞外激酶和p38促分裂原活化蛋白的激发模式[10]，使B 细胞不能增殖分化为浆细胞，从而减少IgG、IgM、IgA的分泌。我们的实验中，hUC-MSCs高表达CD44，不表达CD31，与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)相同，而且hUC-MSCs比其他组织来源的MSCs更原始，更具有增殖分化能力。本实验发现在hUC-MSCs∶单个核细胞为2∶10时IgG、IgM分泌量较无hUC-MSCs时明显减少，与相关文献[11]一致。说明hUC-MSCs可以抑制B细胞分化为浆细胞。

Blimp- 1是由prdm1基因编码的转录抑制因子，可以诱导成熟B淋巴细胞发育为浆细胞，被称作“B淋巴细胞终极分化的主调控子”。成熟B淋巴细胞分化为浆细胞需多个转录因子共同参与，其中PAX5、BCL- 6、MITF、MTA3、BACH2参与B细胞分化，Blimp、XBP- 1、IRF- 4参与浆细胞分化。Asari等[12]认为将B细胞和MSCs共培养可抑制Blimp- 1 mRNA的表达，本实验也证明hUC-MSCs和B 细胞共培养，Blimp- 1蛋白表达下降，从而减少B细胞向浆细胞分化。

本实验中，hUC-MSCs对IgG、IgM及Blimp- 1蛋白的抑制程度，并不和其浓度成正比，这和Bertolo等[13]的实验相似，Bertolo等在体外将人MSCs和人椎间盘组织共培养，发现人MSCs 50 000个/孔时对IgG的抑制率反而低于人MSCs为10 000/孔时的抑制率。有学者认为人MSCs对B细胞的活性无影响，但抑制B细胞的增殖，使其停滞在G0/G1期[11]。本研究未进行B细胞增殖相关的实验，对于hUC-MSCs是否使B细胞停滞于细胞周期某一时期还有待进一步研究。

综上，本实验结果表明hUC-MSCs可以抑制Blimp- 1蛋白从而抑制rITP患者外周血B细胞向浆细胞分化，减少IgG、IgM的分泌，为临床骨髓移植治疗rITP提供一定的实验依据，但其他作用机制及临床治疗剂量仍需探索。

[1]Fang B, Song YP, Li N, et al. Resolution of refractory chronic autoimmune thrombocytopenic purpura following mesenchymal stem cell transplantation: a case report[J]. Transplant Proc, 2009,41:1827- 1830.

[2]Wu LF, Wang NN,Liu YS,et al. Differentiation of Wharton’s jelly primitive stromal cells into insulin-producing cells in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Tissue Eng Part A, 2009,15:2865- 2873.

[3]Can A, Karahuseyinoglu S. Concise review: human umbilical cord stroma with regard to the source of fetus-derived stem cells[J]. Stem Cells,2007,25: 2886- 2895.

[4]Seshareddy K, Troyer D, Weiss ML. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton’s Jelly of umbilical cord[J]. Methods Cell Biol, 2008,86:101- 119.

[5]马大烈, 白辰光. 免疫组织化学阳性标记结果的观察和判断[J]. 临床与实验病理学杂志, 2003, 19: 557- 559.

[6]Fields AC, Cotsonis G, Sexton D, et al. Survivin expression in hepatocellular carcinoma: correlation with proliferation, prognostic parameters, and outcome[J].Mod Pathol, 2004,17:1378- 1385.

[7]Gieseke F, Kruchen A, Tzaribachev N,et al. Proinflammatory stimuli induce galectin- 9 in human mesenchymal stromal cells to suppress T-cell proliferation[J]. Eur J Immunol,2013,43:2741- 2749.

[8]Duffy MM, Ritter T, Ceredig R,et al. Mesenchymal stem cell eff ects on T-cell eff ector Pathways[J]. Stem Cell Res Ther,2011,2:34.

[9]Nasef A, Chapel A, Mazurier C,et al. Identification of IL- 10 and TGF-beta transcripts involved in the inhibition of T-lymphocyte proliferation during cell contact with human mesenchymal stem cells[J]. Gene Expr, 2007,13:217- 226.

[10] Tabera S, Pérez-Simón JA, Díez-Campelo M,et al. The effect of mesenchymal stem cells on the viability,proliferation and differentiation of B-lymphocytes[J]. Haematologica,2008, 93:1301- 1309.

[11] Corcione A, Benvenuto F, Ferretti E, et al. Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions[J].Blood, 2006,107: 367- 372.

[12] Asari S, Itakura S, Ferreri K, et al. Mesenchymal stem cells suppress B cell terminal differentiation[J]. Exp Hematol, 2009,37: 604- 615.

[13] Bertolo A, Thiede T, Aebli N,et al.Human mesenchymal stem cell co-culture modulates the immunological properties of human intervertebral disc tissue fragmentsinvitro[J]. Eur Spine J,2011, 20:592- 603.