天津部分猪场副猪嗜血杆菌的分离鉴定

杨春蕾，池晶晶，张　莉，路　超，王利丽，任卫科

(天津市畜牧兽医研究所,天津 300382)



天津部分猪场副猪嗜血杆菌的分离鉴定

杨春蕾，池晶晶*，张莉，路超，王利丽，任卫科

(天津市畜牧兽医研究所,天津 300382)

摘要：为了解天津部分地区2014年副猪嗜血杆菌病的发病情况及菌株的致病力，收集本地区45个规模化养猪场疑似副猪嗜血杆菌病猪的病料53份，通过病原分离培养、培养特性及染色特性观察、生化试验及PCR扩增等方法进行鉴定，最终分离到阳性样品15例，阳性率28.3%；挑选2株(TJ-0121A，TJ-0134A)分离于临床症状典型病猪，且生物学特性典型的分离株进行豚鼠副猪嗜血杆菌的人工感染试验，每只豚鼠腹腔注射2.0×109 CFU/mL菌液。TJ-0121A分离株接种豚鼠后，豚鼠全部死亡；TJ-0134A分离株感染7 d后未出现死亡。对所有豚鼠的肝、肺、脾、淋巴结、肾、心肌进行副猪嗜血杆菌分离和PCR检测，TJ-0121A组死亡豚鼠的所有组织均可分离并检测到副猪嗜血杆菌；TJ-0134A组豚鼠仅肺脏分离检测到副猪嗜血杆菌，说明不同菌株间的致病力存在差异。

关键词：副猪嗜血杆菌；猪；分离;鉴定

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis, HPs)为巴氏杆菌科嗜血杆菌属，为革兰阴性、多形态的短小杆菌，是常规饲养猪群的上呼吸道中一种常在菌。HPs能感染2周龄～4月龄的猪，主要发病阶段为断奶前后和保育阶段，常见于5周龄～8周龄，发病率为10%～15%，严重时病死率达50%[1]。HPs可引起猪的腹膜炎、脑膜炎、关节炎和纤维素性浆膜炎等，并可与其他病原如猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)病原混合感染[2-4]。近年来，该病在猪场的感染率和病死率日渐增高，是危害养猪业较为严重的细菌性疾病之一。本试验收集2014年天津部分地区发病猪场的疑似副猪嗜血杆菌病猪病料，通过对病原分离培养、培养特性及染色特性观察、生化试验及PCR扩增等进行鉴定，并对2株分离于临床症状典型病猪且生物学特性典型的分离株进行豚鼠副猪嗜血杆菌的人工感染试验，以期了解本地区的发病情况和分离菌株的致病力，为天津地区该病的防控及下一步副猪嗜血杆菌人工感染豚鼠模型建立奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病料来源收集2014年天津地区不同区县的45个规模化养猪场疑似副猪嗜血杆菌病猪病料，无菌采集53头病猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结、关节液等病料。

1.1.2主要试剂和培养基 dNTPs、10×PCR buffer、Taq酶等，宝生物工程(大连)有限公司产品；基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、普通营养琼脂培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司产品；微量生化反应鉴定管，杭州天和微生物试剂有限公司产品。巧克力NAD琼脂平板培养基。

1.1.3实验动物清洁级豚鼠购自军事医学科学院实验动物中心。

1.2方法

1.2.1病原菌的分离培养 无菌采集病猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结、关节液等病料，接种于巧克力NAD琼脂平板上，37℃培养24 h～48 h，选取单个菌落进行革兰染色，观察结果，保存备用。

1.2.2生化试验 将分离得到的疑似菌分别接种D-核糖、木糖、麦芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、山梨糖、山梨醇、甘露醇、β-半乳糖、脲酶、硫化氢微量生化反应管中，同时在生化鉴定管中加入一定量的NAD，置于培养箱，37℃培养24 h～48 h。

1.2.3PCR鉴定 参照HPs 16 S rRNA基因序列设计引物，上游引物5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′，下游引物5′-GCGGCTTCGTCACCCTCTGT-3′，由金唯智生物科技有限公司合成，预期扩增的片段大小为826 bp。反应体系为：10×PCR buffer 2 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，模板1 μL，rTaq酶0.5 μL，补充ddH2O至20 μL。反应参数为：94℃ 7 min;95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 45 s，30个循环;终末延伸72℃ 10 min。

1.2.4分离株致病力试验 根据副猪嗜血杆菌的生物学特性及临床表现，选用分离病猪临床症状典型并经测序鉴定的两株分离菌株(TJ-0121A，TJ-0134A)，每组分别按照浓度2.0×109CFU/mL腹腔注射豚鼠各6只，6只对照组豚鼠注射灭菌生理盐水。注射后临床观察7 d，记录实验动物的临床表现，记录豚鼠出现死亡时间，统计死亡率，对死亡豚鼠进行剖检，观察并记录各个组织器官的病变。实验动物死亡后，无菌采集肝、肺、脾、淋巴、肾、心肌组织样品，接种巧克力NAD琼脂进行HPs分离，并使用建立的PCR方法进行鉴定，记录人工感染后的各个脏器的感染情况。

2结果

2.1细菌的分离培养及形态观察

将临床样品接种于巧克力NAD琼脂平板，37℃培养48 h后，共分离到15株HPs疑似菌株，菌落纯化培养，观察到针尖大小、圆形、灰白色半透明、光滑湿润、边缘整齐的菌落。挑取单个菌落经革兰染色后在显微镜下观察，可见革兰阴性细小杆菌，且呈球杆状、长杆状、短杆状及长丝状多种不同形态的菌体。

2.2生化试验结果

麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇均为阳性；D-核糖、果糖、阿拉伯糖、山梨醇、硫化氢均为阴性；木糖、山梨糖、β-半乳糖、脲酶等反应不完全一致。15个分离株生化试验结果符合副猪嗜血杆菌的生化特性(表1)。

表1　15个分离株生化试验结果

2.3分离株PCR检测结果

15个分离株经PCR检测均扩增出大小约为826 bp的目的片段(图1)。

1.HPS-1;2.HPS-2; 3.HPS-3;4.HPS-4; 5.HPS-5;6.HPS-6;7.HPS-7;8.HPS-8;9.HPS-9;10.HPS-10;11.HPS-11;12.HPS-12;13.HPS-13;14.HPS-14; 15.HPS-15;16.阳性对照;17.空白对照; M.DNA 标准 DL 2 000

1.HPS-1;2.HPS-2;3.HPS-3;4.HPS-4;5.HPS-5;6.HPS-6;7.HPS-7;8.HPS-8;9.HPS-9;10.HPS-10;11.HPS-11;12.HPS-12;13.HPS-13;14.HPS-14;15.HPS-15;16.Positive control;17.Blank control;M.DNA Marker DL 2 000

图1分离株PCR电泳结果

Fig.1PCR results of isolation strains

2.4分离株致病力试验

将2个分离株分别接种6只豚鼠，结果表明，TJ-0121A分离株感染豚鼠6 h后，豚鼠出现精神沉郁、震颤、背毛竖立、相互拥挤，16 h出现死亡，24 h内6只豚鼠全部死亡，死亡豚鼠无任何肉眼可见的脏器病变；TJ-0134A分离株感染豚鼠6 h～24 h，豚鼠表现精神沉郁、行动缓慢等症状，7 d后未出现死亡，将存活豚鼠进行处死，所有处死豚鼠脾脏均可见白色纤维素性渗出，部分豚鼠可见皮下出血、接种部位皮下脓肿，花斑样肾脏等(图2～图5)。

TJ-0121A试验组死亡豚鼠的肝、肺、脾、淋巴结、肾、心肌组织均分离到副猪嗜血杆菌且PCR检测均为阳性，TJ-0134A试验组仅肺脏分离到副猪嗜血杆菌且PCR仅肺脏为阳性。对照组未分离到细菌。

图2　接种部位脓肿

图3　脾脏白色渗出物

图4　皮下出血

图5　花斑状肾脏

3讨论

由副猪嗜血杆菌引起的疾病已成为导致保育猪死亡的主要原因之一，副猪嗜血杆菌由Glasser于1910年首次报道，但1922年才首次分离到细菌，随着副猪嗜血杆菌病的流行，该病的发生在世界各地均有报道[5-6]。副猪嗜血杆菌是一种NAD依赖型、非溶血性、革兰阴性多形性杆菌，人工培养时对营养和环境要求苛刻[7]。且由于副猪嗜血杆菌是呼吸道的常在菌，培养条件苛刻，故检出率很低，不易于本菌的分离和鉴定工作的开展。有研究发现，对于中等毒力株(血清4型)的感染以胸膜液、腹膜纤维性渗出和积液、肺和心包液为最佳采样点，强毒力株(血清12型)的感染，以肺、心血、关节和脑为最佳采样点[8]。HPs可引起仔猪多发性浆膜炎、脑膜炎、关节炎等全身性感染疾病。病情严重的仔猪病料同时会分离到大肠埃希菌、链球菌、金黄色葡萄球菌或与副猪嗜血杆菌相似的吲哚放线杆菌、小放线杆菌等细菌，不易于鉴别和区分[9]。

本试验收集天津地区45个规模化养猪场疑似副猪嗜血杆菌病猪的病料53份，通过病原分离培养、培养特性及染色特性观察、生化试验及PCR扩增等方法进行鉴定，最终分离到阳性样品数15例，阳性率28.3%，说明副猪嗜血杆菌病在天津地区流行广泛，且发病率较高，提示该地区应做好副猪嗜血杆菌病的防御措施。

高鹏程等[10]研究表明，豚鼠是对副猪嗜血杆菌较敏感的实验动物，且用气管、肺内和腹腔注射的感染方式敏感性明显高于其他的接种途径，而腹腔感染更为简捷、易操作，故本试验挑选2株分离于临床症状典型病猪且生物学特性典型的分离株进行豚鼠副猪嗜血杆菌的人工感染试验。结果表明，TJ-0121A分离株接种豚鼠后，豚鼠全部死亡，且所有豚鼠的肝、肺、脾、淋巴、肾、心肌均能分离并检测到HPs；TJ-0134A分离株感染7 d后未见异常，且仅肺脏分离检测到HPs。说明不同分离菌株的致病力存在差异。徐惠娟等[11]指出，副猪嗜血杆菌各血清型菌株间的致病力存在较大差异，且还具有明显的地方性特征，试验中选取的2株分离株致病力存在明显差异，因此还需进一步分析本地区目前流行的血清型，并有针对性的开发相应血清型疫苗，才能

够有效的预防和控制本病的流行。

参考文献:

[1]李尚华,剡根强,王静梅,等.副猪嗜血杆菌新疆株的分离及PCR鉴定[J].畜牧与兽医,2009,41(4):71-73.

[2]Simone O,Carlos P.Haemophilusparasuis:new trends on diagnosis, epidemiology and control[J].Vet Microbiol,2004,99(1): 75-78.

[3]万世平,王建,葛菲菲,等.副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用[J].动物医学进展,2009,30(1): 9-12.

[4]王建,邵卫星,吕占军,等.2012年我国部分省市规模化猪场副猪嗜血杆菌分离鉴定及菌株血清分型[J].动物医学进展,2014,35(3):48-52.

[5]Oliveira S，Pijoan C.Computer-based analysis ofHaemophilusparasuisprotein fingerprints [J].Can J Vet Res,2004,68: 71-75.

[6]王乐,赵战勤,薛云,等.副猪嗜血杆菌国内流行血清型菌株的致病性比较研究[J].中国兽医学报,2014,34(11):1748-1752.

[7]尹秀凤,王艳,姜平,等.副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与应用[J].中国兽医学报,2007,27(2): 80-183.

[8]Turni C，Blackall P J.Comparison of sampling sites and detection methods forHaemophilusparasuis[J].Aust Vet J,2007,85(5):177-184.

[9]王晨燕,林裕胜,车勇良,等.副猪嗜血杆菌病诊断方法研究进展[J]. 动物医学进展,2014,35(1):86-90.

[10]高鹏程,储岳峰.副猪嗜血杆菌感染豚鼠试验及在其体内的分布[J].畜牧兽医学报，2009, 40(9):1376-1382.

[11]徐惠娟,薛云.副猪嗜血杆菌国内流行血清型菌株的生物学特性比较研究[J].中国兽医学报,2014,34(5):729-735.

Isolation and Identification ofHaemophilusparasuisin Part Pig Farms of Tianjin

YANG Chun-lei，CHI Jing-jing，ZHANG Li，LU Chao，WANG Li-li， REN Wei-ke

(TianjinInstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience,Tianjin,300382,China)

Abstract:In order to understand the morbidity of Haemophilus parasuis(HPs) infections in Tianjin area and the pathogenicity of isolated strains,53 sick piglet samples were collected from 45 scale pig farms.15 samples were identified as HPs by cultural characters and staining property analysis,biochemical tests and PCR assay,the positive rate reached 28.3%.Two strains(TJ-0121A，TJ-0134A) with typical clinical symptoms and biological characteristics were selected to infect guinea pigs.Each guinea pig was inoculated with 2.0×109 CFU/mL HPs by intraperitoneal injection.The result showed that one group of guinea pigs were all dead after inoculation,and the other group had no obvious symptoms after inocution with TJ-0134A strain 7 days.Isolation and PCR assay were adopted to detect HPs from liver,lung,spleen,lymph nodes,kidney,heart muscle of guinea pigs,HPs existed in all tissues of dead guinea pigs inoculated with TJ-0121A strain, and the HPs were only detected in lungs of guinea pigs inoculated with TJ-0134A strain.The result indicated that different pathogenicities existed with different strains.

Key words:Haemophilus parasuis;pig;isolation;identification

文章编号:1007-5038(2016)03-0063-04

中图分类号:S852.612

文献标识码:A

作者简介：杨春蕾(1986-)，女，天津人，实习研究员，硕士,主要从事动物病原微生物学研究。 *通讯作者

基金项目：天津市农业科学院院长基金项目(11013)

收稿日期：2015-04-12