犬源大肠埃希菌对β-内酰胺类药物的耐药表型和耐药基因检测



犬源大肠埃希菌对β-内酰胺类药物的耐药表型和耐药基因检测

摘要:为研究犬源大肠埃希菌的耐药情况，对成都地区采集的犬肛门拭子进行细菌分离鉴定，共分离156株大肠埃希菌,同时，进行5种抗生素耐药性检测和β-内酰胺类药物耐药基因的菌株筛选。结果显示，大肠埃希菌对β-内酰胺类耐药率较高，头孢喹肟100%，氨苄西林73.1%，但对美罗培南敏感率高达95.5%。采用PCR方法检测β-内酰胺类药物常见的3种耐药基因blaCTX-M、blaSHV和blaTEM，blaCTX-M检出率最高为89.74%, blaTEM为78.84%，blaSHV无检出。耐药性和耐药基因比较表明,犬源大肠埃希菌β-内酰胺类的耐药性与耐药基因型检出率基本呈正相关，为成都犬源大肠埃希菌β-内酰胺类药物的耐药现状和疾病治疗提供了理论依据。

关键词:犬；大肠埃希菌；β-内酰胺类耐药基因；耐药性

大肠埃希菌(Escherichiacoli)广泛分布于自然界和犬肠道内，主要因饲养管理不当、天气骤变而引起疾病。临床上以腹泻和尿路感染常见[1-2],随着β-内酰胺类药物的广泛应用，耐药的相关报道屡见不鲜。犬携带的耐药菌很可能通过接触传播给人类[3]，从而引起严重的公共卫生问题。我国流行的β-内酰胺类药物耐药基因主要为blaTEM、blaSHV、blaCTX-M[4]。本试验对成都地区分离的156株犬源大肠埃希菌进行最小抑菌浓度测定(MIC)，了解犬源大肠埃希菌对β-内酰胺类药物的耐药情况，并采用PCR方法为大肠埃希菌耐药性的快速检测及耐药基因的分子流行病学调查提供手段。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品来源2014年5月到8月，从成都市4家宠物医院采集健康或患病犬肛拭子共175份，并立即送至实验室进行细菌分离培养鉴定。

1.1.2药品和试剂 2×TaqMaster Mix，购自北京天根生物科技公司；大肠埃希菌显色培养基，购自郑州博赛生物有限公司；麦康凯培养基、伊红美蓝培养基和MH肉汤，购自青岛海博生物试剂有限公司；质控大肠埃希菌ATCC25922，由西南民族大学动物医学实验室提供; 氨苄西林、美罗培南，购自中国食品药品检定研究院；头孢喹肟，购自中国兽医药

品监察所；PCR仪，购自苏州东胜兴业科学仪器有限公司；电泳凝胶成像系统，Bio-Rad公司产品。

1.2方法

1.2.1细菌分离鉴定无菌将样品接种于含LB肉汤EP管中，37℃培养过夜。然后用接种环蘸取菌液划线在麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板上，观察结果。将可疑菌落进行革兰染色、镜检。并取纯化菌落于大肠埃希菌显色培养基进行鉴定。

1.2.2药敏试验采用测定最小抑菌浓度(MIC)方法[5]，对156株大肠埃希菌进行氨苄西林、头孢喹肟、美罗培南3种药物药敏试验，同时用大肠埃希菌 ATCC25922作为质控菌株 ，每种抗生素做3个重复，以未变浑浊的最后1孔所对应的药物浓度作为该药的最小抑菌浓度。耐药判定标准参考美国临床实验室标准化委员会推荐的操作程序和标准(NCCLS，2014)进行[6]。

1.2.3细菌β-内酰胺类药物耐药基因PCR检测根据文献[7]已发表β-内酰胺类药物常见耐药基因blaCTX-M、blaSHV和blaTEM基因序列(表1)。用酚-氯仿方法提取DNA。采用25 μL PCR反应体系：2×TaqMaster Mix为12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，用ddH2O补至25 μL；PCR引物合成和测序均由上海生工生物工技术服务有限公司完成。

表1　引物信息

2结果

2.1细菌形态及染色特性

该菌在麦康凯琼脂上可形成红色不透明中等大

小光滑菌落，在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色且带金属光泽的单个菌落。在显色培养基可形成蓝绿色中等大小的菌落。挑取单菌落染色镜检可见，革兰染色阴性(即红色)、中等大小、两端钝圆的短杆菌[8]。根据培养特性、革兰染色有156株符合大肠埃希菌特征。

2.2药敏试验结果

156株犬源大肠埃希菌对第4代动物专用头孢类抗生素头孢喹肟耐药率为100%，氨苄西林耐药率为73.1%， 但对美罗培南敏感性很高(95.5%)，针对大肠埃希菌治疗效果最佳，对5种β-内酰胺类抗菌药物的耐药情况见表2。

表2　犬源大肠埃希菌对抗生素的敏感性

2.3β-内酰胺类药物耐药基因PCR检测结果

对临床分离的156株犬源大肠埃希菌进行PCR扩增，PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，blaCTX-M、blaSHV均获得与预期目的片段大小相符的扩增条带，所有菌株均未扩增出blaSHV型条带。blaCTX-M阳性率为89.74%(140/156)，blaTEM阳性率为78.84%(123/156)，blaSHV无检出,部分菌株耐药基因检测结果见图1和图2。

2.4耐药表型与耐药基因的相关性

对156株犬源大肠埃希菌进行药敏试验，114株对氨苄西林耐药，约占73．1%，156株对头孢喹肟全部耐药，耐药率为100%，7株对美罗培南耐药，约占4.5%。与本次检测 β-内酰胺类药物耐药表型和耐药基因符合率的比较结果见表3。 符合率从高到低依次为头孢喹肟(89.74%) 、氨苄西林 (78.84%) 、美罗培南(0 )。

M.DNA 标准 DL 2 000；N．阴性对照；1～6．临床分离株PCR扩增产物

M.DNA Marker DL 2 000；N.Negative control； 1-6．PCR products of clinical isolates

图1部分菌株 blaCTX-M基因检测结果

Fig.1The results of blaCTX-Mgenes detected from a part of strains

M.DNA 标准 DL 2 000；N．阴性对照；1～6．临床分离株PCR扩增产物

M．DNA Marker DL 2 000；N.Negative control；1-6．PCR products of clinical isolates

图2　部分菌株blaTEM基因检测结果

3讨论

当前犬源大肠埃希菌的耐药性逐渐增强，与2007年—2008年何柳等[9]报道结果相比，犬源大肠埃希菌对头孢喹肟的耐药率已明显升高，对氨苄西林的耐药率持平，156株犬源大肠埃希菌对头孢喹肟、氨苄西林耐药性较高，耐药率均在50%以上。可能是临床治疗大肠埃希菌感染滥用抗生素和无指征用药的缘故，导致细菌在抗生素选择性压力下出现耐药[10]。而且犬源大肠埃希菌对这些抗生素出现高耐药率势必对公共卫生造成严重威胁。

156株犬源大肠埃希菌携带β-内酰胺酶耐药基因blaCTX-M检出阳性率为89.74%(140/156)，blaTEM检出阳性率为78.84%(123/156)，blaSHV无检出, 而底丽娜等[11]报道新疆地区203株猪源大肠埃希菌耐药基因blaCTX-M检出阳性率为0.99%(2/203)，blaTEM检出阳性率为40.89%(83/203)，耐药基因检出率有显著差异可能与菌株的来源和抗生素使用频率等原因有关[12]。

β-内酰胺类耐药表型和耐药基因检测结果符合率基本呈正相关。而表2中美罗培南耐药菌株未检出blaSHV耐药基因，但却表现了耐药性，有些菌株携带1种或2种耐药基因，但未表现出耐药性。这些情况出现可能耐药基因未能得到有效表达或携带其他耐药基因；从而未能发挥出其耐药的功能[13]。而目前细菌药敏试验检测耗时较长，而临床治疗在未得到药敏结果时往往按照经验用药[14]。分子水平的检测结果和耐药表型有较好的相关性，有望成为一种新的耐药性诊断方法。

参考文献：

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Detection of Drug Resistance Patterns and Drug Resistance Genes ofE.coliIsolated from Dogs to β-lactam Antibiotics

WEN Juan1，YANG Xiao-nong1,ZHU Zi-feng2,JI Hui-shu1,XU Xiao-tong1

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan,610041,China；2.ThehospitalofSouthwestUniversityforNationalities，Chengdu，Sichuan,610041,China)

Abstract:In order to investigate the drug resistance of Escherichia coli derived from dogs in Chengdu,the anal swabs were collected for isolation and identification of E.coli.The results showed that 156 E.coli strains were isolated.And then the drug resistance of 5 kinds of antibiotics and strain screening of β-lactams drug resistance genes were detected.The results showed that the resistance rates to β-lactam antibiotics were high:Cefquinome(100%),ampicillin (73.1%),and with the highest sensitive rate to meropenem (95.5%).Finally,there were 3 kinds of the common resistance genes blaCTX-M,blaSHV and blaTEMof β-lactam antibiotics were tested.The result showed that the blaCTX-Mgene had the highest rate(89.74%),the next was blaTEMgene (78.84%),and the blaSHV gene was not detected.The result showed that there was a positive correlation between the drug resistance and the detection rate of the drug resistance genotype to β-lactam antibiotics.This study provided a theoretical basis for drug resistance status of β-lactam antibiotics in dogs of Chengdu,and it also may play a important role in disease treatment.

Key words:dog;Escherichia coil；β-lactamase resistance gene；drug resistance

文章编号:1007-5038(2016)03-0078-03

中图分类号:S852.612

文献标识码:A

作者简介：文娟(1988-)，女，四川南部人，硕士研究生，主要从事小动物疾病研究。 *通讯作者

收稿日期：2015-06-30

文娟1，杨晓农1*，朱子凤2，徐小桐1，计慧姝1

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041；2.西南民族大学校医院，四川成都 610041)