抗菌肽在细菌感染动物模型中的抗菌活性和毒性评价方法研究进展

黄海凤，缑三虎，马银云，倪京满

(兰州大学药学院药剂学研究所，甘肃兰州 730000)



抗菌肽在细菌感染动物模型中的抗菌活性和毒性评价方法研究进展

黄海凤，缑三虎，马银云，倪京满*

(兰州大学药学院药剂学研究所，甘肃兰州 730000)

摘要：抗菌肽作为新型的潜在抗菌药物，在耐药问题日益严峻的今天引起了广泛关注。在对抗菌肽体外研究不断深入的同时，抗菌肽体内研究也逐渐成为关注重点。论文主要从抗菌肽的体内抗菌活性研究和毒性评价两个方面进行了综述，在体内抗菌活性研究中介绍了模型设计及动物试验原则、接种途径和模型鉴定方法，并对常用于抗菌肽体内研究的几种典型细菌感染动物模型建立及活性试验方法进行了总结，在毒性评价中主要介绍了测定半数致死量(LD50)法，同时对建模及活性毒性评价研究中的不同方法进行了对比分析。

关键词：抗菌肽；动物模型；抗菌活性评价；毒性评价

感染性疾病的普遍发生严重威胁着人类健康，抗生素作为抵抗感染性疾病的一线药物被广泛使用。但是，抗生素滥用导致了耐药细菌的出现，因此新型抗菌药物的研发成为近些年来的研究热点。抗菌肽是先天免疫效应中的重要成分，广泛存在于原核生物、植物、昆虫、两栖动物和哺乳动物体内，具有抗菌谱广、特异性高等生物活性特点，同时还具有调节宿主免疫的作用，这些特点引起了人们的关注，并对其进行大量的研究。

纵观对抗菌肽的已有研究，目前大多数主要集中于体外试验。对体外研究成熟的抗菌肽必须进一步进行体内试验，体内研究能够为抗菌肽应用于临床奠定重要基础。而目前抗菌肽体内研究主要集中于体内抗菌活性和体内毒性的试验。本文在查阅国内外相关文献的基础上，对抗菌肽体内研究中的细菌感染动物模型建立、抗菌活性评价方法，以及体内毒性研究进展进行了总结。

1抗菌肽体内抗菌活性研究

通过抗菌肽体外研究了解其抗菌谱，进一步考察其在体内的抗菌效果时，选取并构建恰当的动物模型是体内活性研究的关键。

1.1模型设计及动物试验原则

建立细菌感染动物模型时要遵循以下原则[6]：①相似性：人工复制的动物模型应尽可能与人类的自发性细菌感染相似。②重复性：理想的感染模型应稳定、可重复，甚至可以标准化。③可靠性：模型应该能够反映出临床上感染情况的病理和症状，同时还要求一定的动物数量来保证模型具有统计学意义。④生物安全性：保证不会造成感染传播、不会对操作人员健康造成威胁，并且可控制。⑤易行性与经济性：所采用的方法应尽量做到容易执行和合乎经济原则。在实验动物管理中，环境调控、日常饲养管理及动物试验等方面均应考虑动物福利。同时，动物试验时应遵循“3R”原则，分别为减少实验动物数、替代实验动物和优化动物试验方法[7]。

目前，用于抗菌肽体内研究的模型动物主要是鼠科类，而使用最多的是小鼠。由于小鼠个体小，生长繁殖快，饲养管理方便，有明确的质量控制标准，品种和品系多，对于多种病原体和毒素具有易感性，反应极为灵敏，并且遗传背景研究详尽，个体差异小，试验结果精确可靠，还可根据试验要求任意选择品种、年龄、体重、性别等，因此被广泛采用。

1.2接种途径

在建立细菌感染小鼠模型时，最关键的问题是接种致病细菌，接种量一般因小鼠体重、菌株及接种途径的不同而不同，在进行抗菌肽体内活性研究前必须探索出合适的接种途径和接种细菌量[8]。目前常用接种途径有以下几种：腹腔注射、静脉注射、皮下接种、鼻腔接种、伤口涂抹接种以及其他特殊方式等。

1.3模型鉴定

细菌感染小鼠模型的鉴定方法一般通过在特定时间对模型组小鼠进行外周血白细胞计数、肝脾等器官的病理切片、或细菌培养等方法来鉴定[9]，同时大量文献一致认为若是致死模型，还可根据模型组小鼠在特定时间全部死亡来界定[10-11]。

1.4常用细菌感染小鼠模型及试验方法

目前文献报道中常用于抗菌肽体内研究的小鼠主要是ICR鼠、Balb/c鼠、昆明小鼠，其他还有转基因鼠等。

1.4.1急性腹膜炎模型细菌性腹膜炎是临床上腹部手术、创伤或腹腔感染的常见并发症，可引起机体多系统的衰竭最终导致死亡。对此模型的疗效研究，能够为临床治疗提供理论依据和试验基础。急性腹膜炎小鼠模型有3种建立方法，分别为大肠埃希菌致小鼠急性细菌性腹膜炎、醋酸致小鼠实验性腹膜炎和肠球菌小鼠毒力相关性腹膜炎[9]。应用于抗菌肽体内疗效研究时常用第一种方法。同时，也可应用其他致病细菌建立模型，如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[10]等。

抗菌肽对小鼠腹膜炎模型疗效的试验方法主要有以下两种：①腹腔注射接种，腹腔注射给药。如Benincasa M等[10]研究了α螺旋抗菌肽BMAP-27和BMAP-28分别对大肠埃希菌(Escherichiacoli)、MRSA、P.aeruginosaATCC 27853致小鼠腹膜炎模型的治疗效果，首先腹腔注射相应致死菌量进行感染，然后立即腹腔注射抗菌肽，观察小鼠存活情况，发现抗菌肽对小鼠感染性腹膜炎具有显著的治疗效果。该研究采用此方法成功建立3种致病细菌腹膜炎模型，并应用抗菌肽评价出其广谱体内抗菌活性。②腹腔注射接种，尾静脉注射给药。Wang Y等[11]研究了Anoplin类似物Anoplin-4对E.coliATCC 25922致小鼠腹膜炎模型的治疗效果，分别在腹腔注射致死菌量感染后1 h和5 h时尾静脉注射抗菌肽高、中、低3个剂量，每天给药2次，给药3 d后观察小鼠死亡情况，至第14天，结果发现在Anoplin-4的中、高剂量呈现明显的抗菌能力且具有剂量依赖性。该试验方法成功评价了Anoplin类似物的体内抗菌活性，但是尾静脉给药方式要求多次给药，这可能与抗菌肽在血清中易被酶降解有关。同时Wang Y等的研究还提示在抗菌肽具有疗效的基础上可以进一步探讨抗菌肽量效关系。

以上两种方法均为腹腔注射感染，仅给药途径不同，但都达到了预期效果。急性腹膜炎小鼠模型的建立操作简便、稳定且重复性好，在抗菌肽体内活性研究中被广泛采用。腹腔注射给药方式使抗菌肽直接作用于感染部位，起效快且给药次数少。而尾静脉注射给药方式使药物直接进入血液循环，通过循环到达感染部位，并且预防感染范围扩大，但是在血清中易被降解或是产生溶血现象，在测定抗菌肽抗菌效果时需根据其性质选择合适的给药方法。

1.4.2菌血症模型菌血症是指外界细菌经由体表或是感染入口进入血液造成的病症，在机体血液内繁殖并随血流在全身播散，最终引起全身性感染，并引发各种炎症而导致死亡。

小鼠的菌血症模型也是抗菌肽体内研究的常用模型，普遍采用腹腔注射接种和腹腔注射给药的方法。例如Eriksson O S等[12]选用CD46转基因小鼠，腹腔注射脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitides)，感染1 h后腹腔注射抗菌肽TP10，分别在治疗前和治疗后1 h采集血样进行细菌计数。结果发现TP10治疗前后血液中细菌量变化与磷酸盐缓冲液(PBS)对照组相比明显不同，显示出TP10具有短时间强力抑杀菌作用。该研究中模型建立方法独特，采用计数细菌的方法使结果更加精准。Tu J C等[13]研究了抗菌肽ZL-2对ICR小鼠(3周龄，18 g～20 g)E.coilATCC 25922致菌血症模型的治疗效果，首先腹腔注射致死量菌液，然后分别在接种后0.5 h和2 h腹腔注射抗菌肽ZL-2高、中、低3个剂量，作用4 h后采集血样，稀释涂布于BHI琼脂平板上进行细菌计数，结果显示抗菌肽组均较PBS对照组小鼠血液中的细菌量显著减少，并呈现剂量依赖性。本组对所设计抗菌肽进行体内活性评价时，选用雌性昆明小鼠(18 g～22 g)，结合了以上两个小组的试验方法，对感染菌量、给药时间、给药剂量与次数不断探索和改善后，成功达到预期效果。

抗菌肽对该模型的作用效果研究通常反映的是抗菌肽短时间对细菌的抑杀作用，腹腔接种的方法建立此模型操作简单易行，稳定且重复性好，试验周期短，被广泛采用。腹腔注射给药方法直接使抗菌肽作用于感染部位，起效快。动物血液中的细菌量作为评价指标体现了动物全身性感染程度，也能够反映出抗菌肽治疗作用的强度大小，同时也是抗菌肽动物体内量效关系研究的常用方法之一。

1.4.3伤口感染模型创伤造成各种不同形式的伤口，如裂伤、割伤、刺伤、盲管伤、穿通伤等，会引起不同类型的感染，其感染程度与伤口的大小、深浅、污染程度等密切相关，严重者会出现高热、昏迷等全身性中毒症状。伤口细菌感染在临床较为普遍，抗菌肽对伤口细菌感染模型的研究一方面能够为临床研究提供依据，另一方面能够拓展抗菌肽体内应用范围。

小鼠的伤口细菌感染模型通常是在小鼠的背部，通过割、刮或烫的方法建立伤口，然后在伤口处接种细菌形成感染模型，再采用不同方式应用抗菌肽考察其抗菌活性。如Ostorhazi E等[14-15]在雌性CD-1小鼠(20 g～25 g)的背部裸露皮肤处烫伤建立伤口，3 h后在伤口处注射致病量MRSA或K.pneumoniae、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)和奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)的混合菌进行感染，然后立即肌肉注射二聚体抗菌肽A3-APO进行观察，5 d后A3-APO处理的小鼠较模型组表现出显著改善软组织和皮肤的状况，并且采集血样和切下伤口处皮肤计数细菌后都显示出细菌数量较对照组显著减少的现象。随后，Ostorhazi E等将A3-APO制成涂剂和喷雾剂进行给药，都显示出比肌肉注射更好的作用效果，其中涂剂的效果最佳。该研究成功建立不同菌种的伤口感染模型，评价了抗菌肽广谱体内抗菌活性，同时研究了抗菌肽的最佳剂型。此外，Feng Q等[16]在ICR小鼠背部用刮刀割的方法建立伤口，涂布金黄色葡萄球菌标准株进行感染后，考察了抗菌肽PL-5和盐酸左氧氟沙星单独及联合用药的效果，切下伤口处组织计数细菌,结果显示,PL-5和盐酸左氧氟沙星较未治疗对照组的细菌数均有明显减少现象，且联合用药显示出更强的治愈效果。Feng Q等在活性评价时引入常用抗生素进行对比，展现出与抗生素相当的抗菌活性，而作用机制的不同，将大大减小耐药问题发生的可能性。

综上所述，该模型为抗菌肽局部作用研究模型，在体内作用效果研究中较为直观，可以根据观察伤口愈合情况和计数伤口处细菌量变化的方法双重评价体内抗菌活性。同时，该模型适合于抗菌肽剂型和联合用药的体内探讨，也能够用于抗菌肽促进伤口愈合能力研究。但是这种方法模型稳定性和重复性略差，且对环境条件及操作的要求也较高，对它的使用有一定的限制性。

1.4.4器官感染模型器官细菌感染在临床上也较为普遍，大致可分为呼吸系统感染、手术部位感染、泌尿系统感染、生殖器官感染等。抗菌肽也可应用于器官细菌性感染模型研究。如Cudic M等[17]研究了抗菌肽对小鼠尿路感染模型的疗效。选用雌性CBA/J小鼠(4周龄～8周龄，16 g～18 g)，首先对Johnson D E等[18]的小鼠尿路感染模型的建立方法进行了改善，经预处理后用聚乙烯导管通过尿道插入膀胱，利用输注泵输入E.coilCFT073细菌悬液进行感染，研究了抗菌肽Pip-pyrr-MeArg二聚体通过尾静脉、皮下、口服等不同给药方式的治疗效果，计数肾脏、膀胱和尿液中的细菌量后发现与未治疗的模型组相比，抗菌肽组都显示出一定的作用效果，其中对肾脏的保护作用最强。Cudic M等采用输注法成功建立小鼠尿路感染模型，考察了抗菌肽3种给药途径的活性，通过计数细菌法评定结果，达到预期目的。同时，Ostorhazi E等[15]研究了二聚体抗菌肽A3-APO对痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)导致的小鼠耳朵痤疮模型的治疗作用，通过局部给药和肌肉注射两种方式考察作用效果，观察痤疮大小，结果均显示出显著的治愈能力，其中局部涂抹的效果更佳。Ostorhazi E等在小鼠耳内成功建立病理模型，同样考察抗菌肽不同方式作用效果，发现直接作用于感染部位的方式效果更好。此外，Mahajan G等[19]研究了抗菌肽PM181104对雌性Balb/c小鼠(18 g～21 g)由MRSA导致的肺部感染模型和耐万古霉素的肠球菌(vancomycin-resistant Enterococci，VRE)导致的肾脏感染模型的作用效果，肺部感染模型采用吸入方式接种，肾脏感染模型采用对预处理后小鼠尾静脉注射接种，随后均采用尾静脉注射给药，分别治疗2 d和3 d后分离肺部组织和肾脏器官计数细菌数量，结果发现与未治疗的模型组相比抗菌肽组均显示出细菌数量明显减少的现象。Mahajan G等的研究采用不同方法建立不同细菌感染的不同器官模型，都采用静脉注射抗菌肽和细菌计数结果的方法，成功评价了抗菌肽PM181104的体内抗菌活性。

由此可见，抗菌肽的间接给药方法体现出一定的靶向性，也为抗菌肽在体内的药代动力学和组织分布研究提供了依据。器官感染模型接种方式一般较为特殊，给药途径多样化，但是应用时首先需要评价抗菌肽在治疗量是否对目标器官有毒性作用，在确保无毒害后方可试验。此外，抗菌肽对此模型作用效果的评价除了计数靶器官细菌变化情况外，还可以对测试器官制成病理切片，通过观察切片的组织细胞变化情况更直观地评价抗菌肽的作用效果。但是，该类模型的建立对环境条件和操作要求较高，甚至要求无菌环境，这些条件限制了这种方法的广泛使用。

1.4.5其他小鼠模型除了以上模型外，抗菌肽体内研究还见于其他小鼠模型。如Ghiselli R等[20]对雄性Balb/c小鼠(25 g～35 g)首先经过结扎小鼠胆管造成慢性梗阻性黄疸后，腹腔注射大肠埃希菌血清型内毒素0111：B4建立内毒素血症模型，然后立即同方式注射抗菌肽BMAP-27及他唑巴坦-哌拉西林，在作用不同时间后测定小鼠血液中内毒素水平并观察小鼠死亡情况，结果发现抗菌肽组较对照组呈现显著的作用效果，并且强于他唑巴坦-哌拉西林。Ghiselli R等证明了BMAP-27在体内不仅能够抑制细菌生长，而且能够灭活内毒素，这给梗阻性黄疸治疗策略提供了新思路。建立类似的模型，能够为开辟抗菌肽在体内更具专一性的抗菌活性研究奠定基础。

1.4.6其他动物模型目前，抗菌肽的体内抗菌活性研究不单局限于鼠类，还拓展于其他动物模型。例如Yin H等[21]选择雏公鸡作为研究对象，首先用灌胃的方法接种早熟艾美耳球虫卵囊(Eimeriapraecoxoocysts)建立家禽球虫病模型，随后立即给抗菌肽LEAP-2和CATHL3[22]，结果显示，与对照组相比抗菌肽组对球虫病的发生有明显改善现象。Yin H等提示抗菌肽LEAP-2和CATHL3在寄生虫促进感染传播或宿主防御衰减感染方面具有一定的改善作用。Heidari M等[23]利用支气管镜接种溶血性曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica)于成年羊肺泡部位，研究了内源性阴离子抗菌肽对M.haemolytica的作用，在0、5、10、20 min时处死羊取肺泡内腔表面细胞在电镜下观察，结果显示内源性阴离子抗菌肽能够迅速附着于细菌表面使细菌失活。Heidari M等选用大体格动物，更加接近于人类，建模方法独特，采用电镜观察法评价结果，探索内源性阴离子抗菌肽在肺泡内的抗菌活性作用。此外，Minardi D等[24]以雄性成熟Wistar大鼠为模型动物，研究了抗菌肽Tachyplesin Ⅲ与哌拉西林-他唑巴坦单独或联合对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)输尿管支架感染的作用效果，结果均显示出显著的抗菌能力，且联合作用更强。Minardi D等的研究模拟细菌附着于体内医疗材料表面形成的感染情况，这种感染严重时会引发细菌生物膜形成顽固性感染，显著的抗菌活性表明抗菌肽Tachyplesin Ⅲ具有抑制体内细菌生物膜形成能力。Aranha C等[25]选择2月龄的雄性和雌性Holtzman大鼠为研究对象，评价了抗菌肽Nisin的避孕潜力，结果发现Nisin具有阴道抗菌和快速杀死精子的双重活性，提示Nisin可以开发成为一种女性阴道疾病预防和避孕产品。

综上所述，选择雏公鸡、羊、大鼠等为模型动物能够用于探索抗菌肽更广泛的应用价值。但是，这类动物模型研究耗资高，操作难度大，稳定性低并且实验条件要求高，可根据抗菌肽特性探索更广泛活性时加以选择。

2抗菌肽体内毒性评价研究

2.1半数致死量(LD50)的测定

体内毒性评价是药物应用于体内活性研究必不可少的步骤。一般常用于抗菌肽体内急性毒性评价的方法是测定LD50。该方法有助于减少所需试验次数，减少量度极端情况所带来的问题，也能与最低有效剂量(ED50)结合计算出治疗指数。同时，这个指标能够直观表述药物的药效 、毒性或效价。LD50有多种计算方法，被普遍采用的是寇氏法和Bliss法[26]。

LD50通常与受试动物体重有关，测定抗菌肽的LD50一般选用小鼠。LD50越大，表明安全范围越大。Li Z J等[27]测定了抗菌肽Hp1404对雌性Balb/c小鼠(18 g～21 g)通过腹腔和尾静脉注射0.4 mL的不同剂量来评价Hp1404在体内的急性毒性，结果显示腹腔注射80 mg/kg的剂量时不引起急性不良症状，并且受试小鼠全部存活；尾静脉注射方式的毒性症状较为明显，且通过寇氏法计算得到LD50为89.8 mg/kg。此外，de Almeida Vaucher R等[28]用同样的方法测定了抗菌肽P34对雄性Balb/c小鼠口服灌胃途径的急性毒性，观察存活情况至48 h后计算LD50高于332.3 mg/kg±0.76 mg/kg。同时de Almeida Vaucher R等还测定了其慢性毒性，每天灌胃一定量，分别记录在第0、7、14、21天小鼠血常规指标，结果发现指标正常可继续服用。这两个小组的研究结果提示,抗菌肽的腹腔、尾静脉、灌胃3种途径中,尾静脉途径产生的毒性最大，这说明抗菌肽直接进入血液循环会增加毒性发生的可能性。因此可以看出，通过不同方式给药引起的毒性大小不同。本组对所设计抗菌肽进行体内急性毒性评价时，采用上述方法，成功评价了其腹腔注射方式的LD50。同时，LD50的大小体现剂量安全范围，也能够为抗菌肽体内活性研究中给药剂量的设计提供依据。

2.2其他评价方法

除了上述毒性评价方法，还见于其他方法。Aranha C等[25]以评级的方法评价抗菌肽Nisin在治疗量对雌性Holtzman大鼠反复阴道内给药的毒性，通过考察阴道上皮细胞的形态学变化和测定血液中血清生化参数进行毒性评级。这种方法通常应用于抗菌肽的亚急性毒性考察，可根据研究目的加以选择。

抗菌肽的毒性评价研究还可以探索并发现新的作用效果。Gupta R等[29]以果蝇为模型对象研究了抗菌肽LR14的毒性程度，不断提高给肽量，通过观察抗菌肽对果蝇发育周期、重量及大小的影响程度，发现LR14在10 mg/mL剂量时不引起毒性，在10 mg/mL～15 mg/mL时引起不同程度的毒性，在15 mg/mL以上时具有了杀虫功效。Gupta R等的研究提示对抗菌肽体内的毒性研究不能局限于评价其在作为抗菌药物时的不良作用，还可以利用毒性来开发新的功效，如作为杀虫剂、防腐剂等。

3小结与展望

在耐药问题日益严重且新的抗生素发现极其困难的情况下，抗菌肽为开发新的抗菌药物开辟了广阔的前景，对抗菌肽的体内研究将加快抗菌肽的研发进程。本文总结了国内外抗菌肽体内研究的动物模型建立和抗菌活性、毒性评价方法研究进展，为抗菌肽体内研究提供借鉴，可以根据抗菌肽的自身特性，以及实验条件，合理选择最佳的动物模型和实验方法进行体内研究。

抗菌肽的体内抗菌效果、毒性评价均为基础研究，还需不断的拓展和完善。目前，进入临床研究的抗菌肽数量不断增加，应用前景良好，基础体内研究将为其临床的吸收、分布及药代动力学研究提供依据。另外，抗菌肽的体内研究领域在不断拓展，包括抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫和抗肿瘤等各种功效，这将为发现抗菌肽新功效提供更广泛的思路。

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Progress on Activity and Toxicity Evaluation of Antimicrobial Peptides in Animal Models of Bacterial infections

HUANG Hai-feng,GOU San-hu,MA Yin-yun,NI Jing-man

(InstituteofPharmaceutics,SchoolofPharmacy,LanzhouUniversity,Lanzhou,Gansu,730000,China)

Abstract:As novel potential antimicrobial agents,antimicrobial peptides cause widespread concern at the growing problem of drug resistance.While in vitro study of antimicrobial peptides is deepening,studies in vivo has become the focus.We reviewed two aspects including antibacterial activity and toxicity in vivo.In vivo antibacterial activity assessment,principles of model design and experimental animals,vaccination approach and model identification method were mainly introduced.The establishment of typical animal models of bacterial infections and the evaluation methods of antibacterial activity were summarized. In the toxicity assessment,the method of median lethal dose (LD50) was mainly introduced.And different methods about two aspects were compared and analyzed.

Key words:antimicrobial peptide;animal model;antibacterial activity;toxicity

文章编号:1007-5038(2016)03-0103-06

中图分类号:S852.3

文献标识码:A

作者简介：黄海凤(1989-)，女，甘肃定西人，硕士研究生，主要从事多肽类药物研究。*通讯作者

基金项目：国家自然科学基金项目(81273440)

收稿日期：2015-07-01