华支睾吸虫感染FVB小鼠的试验研究

张蓓蓓，张　波，沈莉萍，李　波，颜　超，汤仁仙，郑葵阳

(徐州医学院病原生物学与免疫学教研室/感染与免疫实验室，江苏徐州　221004)



华支睾吸虫感染FVB小鼠的试验研究

张蓓蓓，张波，沈莉萍，李波，颜超，汤仁仙，郑葵阳*

(徐州医学院病原生物学与免疫学教研室/感染与免疫实验室，江苏徐州221004)

摘要：为了观察华支睾吸虫感染FVB小鼠肝脏组织病理变化，将12只健康雌性FVB小鼠随机分成2组，分别为正常组与感染组，每组6只。感染组小鼠经口灌饲45个华支睾吸虫囊蚴。于感染后25 d用NaOH消化法检测粪便虫卵阳性率，感染后第112天收集肝脏组织，进行HE染色及Masson染色观察肝脏病理变化情况；收集外周血，ELISA检测血清中华支睾吸虫特异性IgG抗体。虫卵检查结果显示，感染组小鼠在感染后25 d检查到虫卵，肉眼观察小鼠肝小叶边缘有白色结节样病变，肝脏表面有白色透明水泡。感染组小鼠血清中华支睾吸虫特异性IgG水平显著高于正常组(P<0.01)。HE染色观察小鼠肝脏组织，见到虫体，炎症细胞浸润严重，纤维化明显并伴有点状坏死。肝细胞肿胀，肝窦狭窄，胆管扩张增生显著，胆管上皮细胞水肿、坏死，部分胆管上皮细胞胞浆均质红染。Masson染色显示肝脏组织尤其是虫体周围出现大面积纤维化。试验结果表明,华支睾吸虫感染FVB小鼠肝脏病变严重，因此可利用该品系小鼠建立华支睾吸虫感染模型，为深入研究华支睾吸虫的致病机制奠定基础。

关键词：华支睾吸虫；FVB小鼠；肝脏；病理变化

华支睾吸虫(Clonorchissinensis)是一种重要的食源性寄生虫，人和犬猫等哺乳动物因食入含有华支睾吸虫囊蚴的鱼虾而感染。成虫寄生于肝胆管，导致胆管的炎症反应，肝脏与胆囊的组织损伤及功能改变，出现胆囊炎、胆管肝炎、胆结石和肝硬化等，更值得注意的是华支睾吸虫感染与胆管细胞癌密切相关，2009年WHO将其列为明确的人类致癌物(1类)[1-2]。最新调查显示,全球约有1 531 万华支睾吸虫感染者，主要分布于中国、韩国、越南和俄罗斯，每年可造成约5 000例死亡和27万伤残调整生命年(disability adjusted life years,DALYs)[3]。因此，加强对华支睾吸虫病的研究及防控十分重要。本研究用华支睾吸虫感染FVB小鼠，观察小鼠肝脏病理改变，为深入探讨华支睾吸虫病的发病机制奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物和囊蚴SPF级健康雌性FVB小鼠12只，8周龄，体重25 g～30 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于徐州医学院实验动物中心SPF级屏障系统。感染华支睾吸虫囊蚴的麦穗鱼购自江苏省邳州市某菜市场。

1.1.2主要试剂苏木素-伊红染色试剂盒，购自江苏碧云天公司；Masson染色试剂盒，购自福州迈新生物技术开发有限公司；HRP标记的羊抗鼠IgG总抗体，美国Abcam公司产品；华支睾吸虫成虫抗原(CA)，由徐州医学院感染与免疫实验室制备。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立

1.2.1.1华支睾吸虫囊蚴的分离参照文献[4-5]，按照传统方法将购自疫区的麦穗鱼消化后解剖镜下分离囊蚴，计数后保存于Alsever's溶液中，保存于4℃备用。

1.2.1.2实验动物感染将12只FVB小鼠随机分成正常组与感染组，每组6只，感染组小鼠每只经口灌饲45个囊蚴，适量生理盐水清洗数遍，保证囊蚴的灌入。

1.2.2粪便检查感染后第25天，收集小鼠粪便，100 g/L NaOH消化粪便过夜，吸管吸取适量沉渣制作涂片3张，显微镜下查找虫卵。

1.2.3病理学观察和组织学观察在感染后第112天，颈椎脱臼法处死小鼠，低温下无菌分离小鼠完整肝脏，肉眼观察小鼠肝脏病变。从小鼠肝脏切取约5 mm×5 mm×2 mm大小组织，置40 g/L多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，2 μm厚度连续切片，HE染色、Masson染色后在显微镜下观察肝脏病理学改变，Image-Pro Plus对纤维化病变进行半定量分析。

1.2.4ELISA检测血清中华支睾吸虫特异性IgG抗体于感染后第112天，摘眼球取血，分离血清。用10 μg/mL华支睾吸虫虫体抗原(CA)包板，4℃过夜；37℃复温30 min；加入待检血清，37℃反应1 h；加入HRP标记的IgG抗体37℃反应30 min，底物反应10 min～30 min后，显色，酶标仪测OD值。

2结果

2.1肝脏组织肉眼观察

感染组小鼠被毛无光泽，腹部隆起，剖杀后观察肝脏组织，感染组6只小鼠肝脏组织尤其是肝左叶肿大明显，包膜紧张，多个白色透明样大水泡突出肝组织表面，切开后有白色清亮液体流出。肝脏色泽偏暗，局部有黑褐色点状斑块，其边缘有白色结节，质韧(图1)。

→.肝脏组织表面白色透明水泡

→.Cystic dilatation on the surface of the liver

A.正常组小鼠肝脏；B.感染组小鼠肝脏

A.Liver of the normal mice;B.Liver of the infected mice

图1正常与华支睾吸虫感染FVB小鼠肝脏组织比较

Fig.1Comparison of liver between normal and infected FVB mice

2.2虫卵检查结果

感染后25 d，小鼠虫卵检查结果显示，5只小鼠虫卵检查阳性，阳性率为83.3%，高于先前报道的C57/BL6小鼠、昆明小鼠、Balb/c小鼠[6]。

2.3HE染色结果

正常组小鼠肝细胞排列整齐，肝小叶结构完整，汇管区无炎性细胞浸润，胆管无扩张增生。感染组小鼠增生的胆管中见及寄生的完整华支睾吸虫成虫虫体，结构清晰可见，子宫内有大量虫卵。胆管管腔主要表现两种形态，一部分为均质红染似玻璃样变，一种为白色透明样的似空泡性变。外围大量纤维组织增生伴炎性细胞浸润。肝细胞溶解坏死，肝小叶结构破坏严重(图2)。

A.正常组小鼠肝脏(100×)；B.正常组小鼠肝脏(400×)；

C.感染组小鼠肝脏(100×)；D.感染组小鼠肝脏(400×)

A.Liver of the normal mice(100×);B.Liver of the normal mice(400×)；

C.Liver of the infected mice(100×);D.Liver of the infected mice(400×)

图2HE染色观察华支睾吸虫感染

FVB小鼠肝脏组织病理变化

Fig.2Hepatic pathological lesions of FVB mice infected with

Clonorchissinensis(HE staining)

2.4Masson染色结果

与正常组相比，经Image-Pro Plus软件计算，感染组小鼠肝脏组织尤其是虫体周围发生大面积纤维化病变，显著高于正常组(P<0.05，图3、图4)。

2.5感染组小鼠外周血中IgG表达水平

ELISA检测小鼠血清特异性抗体，与正常组相比，感染组小鼠血清特异性抗体显著升高(P<0.01，图5)。

3讨论

华支睾吸虫是明确的胆管癌致癌物[6]，为深入研究和有效防控华支睾吸虫病，需要借助易感的动物模型进行试验研究。先前已用过的家兔、豚鼠、沙鼠、狗和猫等动物[7-8]，均缺少相应的商品化试剂，其应用受到一定限制。小鼠具有形体小、经济、饲养容易等优点，用于研究其免疫、病理生理功能等所用试

A.正常组小鼠肝脏(40×)；B.正常组小鼠肝脏(100×)；

C.感染组小鼠肝脏(40×)；D：感染组小鼠肝脏(100×)

A.Liver of the normal mice(40×);B.Liver of the normal mice(100×)；

C.Liver of the infected mice(40×);D.Liver of the infected mice(100×)

图3Masson染色观察华支睾吸虫感染

FVB小鼠肝脏纤维化病理变化

Fig.3Liver fibrosis in the infected FVB mice (Masson staining)

图4　Masson染色观察华支睾吸虫感染

图5　ELISA法检测华支睾吸虫感染

剂齐全，且多已商品化，是研究华支睾吸虫病的致病机制的理想模型。张荣光[9]报道与家兔、大鼠和沙鼠等动物相比，小鼠感染华支睾吸虫后的成虫检出率低。本实验室前期对Balb/c小鼠、昆明小鼠和C57/BL6小鼠对华支睾吸虫易感性进行研究发现，不同品系小鼠存在很大差异，其中Balb/c小鼠较为易感，其次是昆明小鼠，再次是C57/BL6小鼠。为进一步寻找对于华支睾吸虫更为易感的实验小鼠，本试验采用FVB小鼠作为感染的试验对象，经观察发现该品系小鼠感染华支睾吸虫后肉眼观小鼠肝脏水泡样病变严重，横切面均可见及虫体，胆管增粗；特异性IgG抗体均为阳性，且虫卵阳性率为83.3%。王贵燕等[10]报道，华支睾吸虫感染豚鼠后肝组织镜下可见虫卵，周围炎症反应严重，并有胆管扩张管壁变厚。本试验中，FVB小鼠肝脏可见成虫，其子宫充满虫卵，虫体周围大量炎性细胞浸润，并有纤维组织包绕。胆管管壁增厚，胆管不仅扩张，增生更为显著，增生的胆管部分管腔均质红染，很可能是因为胆管堵塞导致胆汁淤积管腔中所致。华支睾吸虫感染宿主肝脏中细胞外基质的产生和降解紊乱，使其大量堆积，从而形成纤维化病变[11-12]。本试验结果显示，感染组小鼠肝脏组织出现大面积纤维化病变，尤其是虫体寄生的胆管及增生的胆管周围甚为严重。FVB小鼠肝脏大面积纤维化，虫体寄生的胆管及增生的胆管周围尤其严重。肝纤维化是华支睾吸虫引起的急慢性肝炎的的最基本的病理特征，是多种肝病的前兆，如肝硬化甚至肝癌，胆管癌。由于肝纤维化是一个相对而言可以自我修复的病变，因此，可通过动物模型研究治疗肝纤维化以达到及时有效的阻止病变进一步发展的目的[13]。

本试验所观察到华支睾吸虫感染FVB小鼠，有感染率高、病变明显、病情持续时间长等特点，可更直观观察华支睾吸虫病的病理学特征，为华支睾吸虫致病机制研究,以及预防和治疗药物的开发提供研究材料。

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Experimental Study onClonorchissinensisInfected FVB Mice

ZHANG Bei-bei,ZHANG Bo,SHEN Li-ping,LI Bo,YAN Chao,TANG Reng-xian,ZHENG Kui-yang

(DepartmentofPathogenicBiologyandImmunology,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu,221004,China)

Abstract:In order to investigate the histopathological lesions in liver of the Clonorchis sinensis infected FVB mice, twelve healthy female FVB mice were divided into two groups:normal and infected model groups randomly (n=6).Each mouse was infected with 45 metacercariae orally.The eggs in the feces which were digested by NaOH solution were found in 25 d post infection.Hematoxylin and eosin (H&E) and Masson's trichrome (MT) were used for analysis of liver pathology.ELISA was used to detect the level of C.sinensis specific IgG in peripheral blood sera which was collected on 112 d post infection (p.i.).There were white nodules and even cystic dilatation in the liver on 112 d p.i.The positive rate of eggs was 83.3% in the infected group, compared with the control.As showed by HE staining,C.sinensis adult worm could be observed,and there were seriously inflammatory cell infiltration and fibrosis tissues with scattered necrosis around biliary ducts.Moreover,the infection resulted in swollen hepatocytes,narrowed hepatic sinusoid and proliferated biliary epithelial cells severely.A large area of fibrosis was accompanied with the proliferated bile ducts around the worm.The level of IgG was significantly higher in the infected group (P<0.01).These data showed severe hitopathological lesions in liver of C. sinensis infected FVB mice.Therefore,the present study may provide experimental basis for further studying the mechanism of clonorchiasis.

Key words:Clonorchis sinensis;FVB mouse; liver;pathological lesion

文章编号:1007-5038(2016)03-0006-04

中图分类号:S852.735

文献标识码:A

作者简介：张蓓蓓(1990-)，女，江苏盐城人，硕士研究生，主要从事寄生虫感染与免疫方面的研究。*通讯作者

基金项目：国家自然科学基金项目(81171590,31302077)；家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放课题(SKLVEB2013KFKT005)；江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)

收稿日期：2015-08-11