一株鸭星状病毒的分离鉴定

刘吉山，李　娇，祖立闯，肖跃强 ，沈志强*，柳增善

(1.吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062； 2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；3.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600)



一株鸭星状病毒的分离鉴定

刘吉山1.2，李娇3，祖立闯3，肖跃强2，沈志强2*，柳增善1*

(1.吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062； 2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；3.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600)

摘要：为对发病鸭场找到致病原，并对病原分离鉴定，丰富病原分子流行病学以及为新型诊断试剂和疫苗的研究奠定基础。通过对发病鸭场病鸭临床症状和病理变化观察，鸭胚传代分离培养及一步RT-PCR检测和扩增序列比对分析，最终确定该鸭场发生鸭病毒性肝炎，病原为鸭星状病毒。鸭星状病毒感染导致鸭肝炎的报道不多，但确是导致鸭肝炎的病原之一，应该引起对该病毒的重视。

关键词：鸭星状病毒；鸭病毒性肝炎；分离；鉴定

鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是危害我国养鸭业重要的病毒性传染病，主要感染3周龄内雏鸭，发病率和病死率均较高[1-2]。该病的病原可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，其中Ⅰ型为鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus， DHAV)，Ⅱ型和Ⅲ型为鸭星状病毒(Duck astrovirus，DAstV)[3-5]。各型病毒引起雏鸭的临床特征极为相似，增加了临床鉴别诊断的难度。一直以来我国鸭病毒性肝炎的主要流行毒株都是DHAV[6-7]，但近年来我国部分地区养鸭场陆续有DAstV感染的病例报道[8-9]，应该对鸭病毒性肝炎的致病原有重新的认识并加强对DAstV的重视。本文从临床疑似鸭病毒性肝炎发病鸭场中分离1株病毒，通过鸭胚病变观察、血凝性检测、病毒半数致死量测定、RT-PCR检测和基因组序列分析鉴定为鸭星状病毒，对发病鸭场找到致病原，丰富了鸭星状病毒的分子流行病学资料，为鸭星状病毒新型诊断试剂和疫苗的研究奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病料来源病料样品采自山东某发病鸭场。

1.1.2主要试剂ExTaq酶、dNTP、DNA Marker DL 2 000、病毒基因组RNA/DNA提取试剂盒、一步RT-PCR试剂盒,宝生物工程(大连)有限公司产品；TRIzol试剂、M-MLV反转录酶、Ribonuclease Inhibitor、质粒DNA提取试剂盒与胶回收试剂盒,北京百泰克生物技术有限公司产品。

1.2方法

1.2.1临床症状与病理剖检观察记录发病鸭场鸭的发病情况、临床症状，对发病鸭进行剖检观察，记录其病理变化。

1.2.2RT-PCR检测分别按照参考文献[10-11]的方法进行鸭甲型肝炎病毒的检测，检测结果均为阴性，怀疑有鸭星状病毒的存在，因此建立了鸭星状病毒一步RT-PCR检测方法(将另文发表)，该方法预期扩增片段大小为373 bp。提取病毒基因组进行一步RT-PCR检测，PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.3病毒分离将采集的鸭肝脏病变组织与灭菌生理盐水以1∶3比例混合，用灭菌研磨器研磨成组织匀浆，反复冻融3次，12 000 r/min 离心15 min，吸取上清液，经0.45 μm滤膜过滤后，经尿囊腔途径接种10日龄鸭胚，0.1 mL/胚，每天照鸭胚2次，弃去24 h内死亡胚，死胚随时冻存，鸭胚培养至120 h，全部放4℃过夜，次日收获鸭胚尿囊液，连续传鸭胚3代。收集每一代鸭胚尿囊液，做好标记。

1.2.4分离株病毒血凝性测定按常规血凝试验(HA)方法测定每代分离毒株尿囊液对10 mL/L鸡红细胞的凝集性。

1.2.5分离株病毒胚胎半数致死量(ELD50)的测定取每代分离毒株尿囊液分别用灭菌生理盐水做10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-53个稀释度分别接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.1 mL/胚，按Reed-Muench法测定每代分离毒株的ELD50。

1.2.6分离株病毒RT-PCR鉴定按1.2.2的方法对分离毒株每一代尿囊液进行RT-PCR检测。

1.2.7PCR扩增产物的测序与鉴定PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，利用胶回收试剂盒对其进行回收纯化，纯化产物连接pMD18-T载体，4℃过夜连接，次日连接产物转化Dpα感受态细胞，选取单克隆增菌培养，用质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA，做PCR和双酶切鉴定，经PCR和EcoRⅠ/HindⅢ双酶切鉴定正确的质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.8测序结果基因组序列分析将测得序列上传NCBI Blast进行序列比较分析。

2结果

2.1临床症状及剖检观察结果

2013年4月，山东某存栏30万只樱桃谷商品肉鸭场14日龄左右雏鸭部分突然死亡，注射鸭甲型肝炎病毒高免卵黄抗体后，甚至连续2次注射，治疗效果不明显，死亡难以控制，1周后缓慢平息，病死率约13%～15 %，几乎每批都发生，无有效的控制措施。其临床症状表现为病鸭萎靡不振，喜卧，不食，发病当天死亡，很多没有临床症状就死亡了，死亡时呈角弓反张姿势，仰卧死亡，剖检可见肝脏极度肿大、质脆、树枝状出血、针尖大小出血点，仔细观察能够识别为出血症状；脾脏肿大表面散布白色病灶，形成“西米脾”外观；肾脏肿胀，血管充盈。临床初步诊断疑似为鸭病毒性肝炎感染。

2.2RT-PCR检测结果

按照参考文献[10-11]的方法利用鸭甲型肝炎病毒经典株和变异株套式RT-PCR检测方法检测的结果均为阴性，用新设的鸭星状病毒检测方法检测结果为阳性，PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳可见大小为373 bp的扩增条带(图1)。

2.3病毒分离结果

临床病料经处理后接种10日龄鸭胚在48 h～72 h出现死亡，到120 h左右基本全部死亡，传至第3代，鸭胚死亡时间全部集中在接种后48 h～72 h，死亡鸭胚严重出血、水肿。

2.4分离株病毒血凝性测定结果

血凝试验(HA)测定每代分离毒株尿囊液对10 g/L鸡红细胞均无凝集性。

2.5分离株病毒胚胎半数致死量(ELD50)的测定结果

按Reed-Muench法测定分离株病毒的ELD50第1代到第3代分别为10-3.83/0.1 mL、10-4.16/0.1 mL和10-4.5/0.1 mL。

2.6分离株病毒RT-PCR鉴定结果

如图2所示，分离毒株每代尿囊液进行RT-PCR检测均呈阳性，PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳可见大小为373 bp的扩增条带，与预期大小相符。

M.DNA 标准DL 2 000;1.临床病料RT-PCR扩增产物;2.水对照

M.DNA Marker DL 2 000;1.RT-PCR products of clinical material;2.Water control

图1临床病料RT-PCR检测结果

Fig.1RT-PCR results of clinical material

M.DNA 标准DL 2 000;1.第1代毒; 2.第2代毒; 3.第3代毒; 4.水对照

M.DNA Marker DL 2 000;1.First generation virus;2.Second generation virus;3.Third generation virus;4.Water control

图2分离毒株RT-PCR检测结果

Fig.2RT-PCR result of isolated strain

2.7分离株病毒PCR扩增产物克隆及酶切鉴定结果

如图3所示，PCR扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，在位于373 bp处有一条特异性DNA扩增条带，PCR扩增产物连接T载体，提取重组质粒，经EcoRⅠ/HindⅢ双酶切鉴定得到了大小为2 900 bp和373 bp的2个条带，表明PCR扩增产物已经连接到T载体中，送测序公司测序鉴定。

M.DNA 标准DL 2 000;1.克隆质粒EcoRⅠ/HindⅢ双酶切

M.DNA Marker DL 2 000;1.Cloned plasmid double enzyme digestion withEcoRⅠ/HindⅢ

图3克隆质粒酶切鉴定结果

Fig.3Result of enzyme digestion of the cloned plasmid

2.8序列分析结果

将测得序列上传NCBI Blast进行序列比较分析，结果表明分离株与WF1201株(JX439643.1)的同源性为99 %，与C-NGB株(FJ434664.1)的同源性为99 %，与DA08株(FJ919227.1)的同源性为97 %，与DA93(FJ919228.1)和DA07(FJ919226.1)株的同源性为96 %，分离毒与上面几个毒株同源性较高，有可能处于一个分支，由于扩增序列较短，全部基因组序列的同源性比较有待进一步研究。

3讨论

鸭病毒性肝炎是目前危害我国养鸭业尤其是雏鸭最为严重的一种急性、烈性、高度致死性传染病，鸭群一旦感染该病毒，可迅速暴发，给鸭场带来灾难性打击。故加强对鸭病毒性肝炎病原的鉴定、诊断技术和防控工作的研究，对保障我国水禽养殖业健康发展意义重大。本研究对某养殖场出现的鸭病毒性肝炎病毒感染雏鸭急性死亡病例进行了RT-PCR检测和病毒分离鉴定，经检测发现此次发病的病原为Ⅱ型鸭星状病毒(DAstV)。各型病毒引起鸭病毒性肝炎的临床症状都很相似，通过临床症状和病理变化观察很难进行分型诊断，病原确诊还需要通过PCR等分子生物学检测方法，PCR检测是动物疾病诊断的一种快速、准确方法，但在诊断过程中往往也存在假阳性和假阴性等问题干扰，建议在诊断过程中同时进行病毒分离培养，根据分离毒的培养情况进一步确诊。DAstV的分离建议使用鸭胚，虽然DAstV在鸡胚上也可以增殖，新毒株往往在鸡胚上表现不适应，病毒滴度较低。也有资料[12]表明，DAstV也可以用细胞来分离，在细胞的培养液中不加血清，加入胰蛋白酶，细胞生长往往没有细胞病变，增加了分离鉴定的难度。故本研究在鸭星状病毒临床病料RT-PCR方法检测阳性的基础上，利用10日龄鸭胚成功分离鉴定出1株鸭星状病毒，该病毒的成功分离鉴定为发病鸭场找到了致病原，同时丰富了我国鸭星状病毒流行病学资料，为进一步研究鸭星状病毒分子流行病学和遗传变异提供了材料，为鸭星状病毒优质疫苗的研制开发奠定了基础。

参考文献:

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[12]殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社,1997.

Isolation and Identification of a Duck Astrovirus Strain

LIU Ji-shan1.2, LI Jiao3, ZU Li-Chuang3, XIAO Yue-qiang2, SHEN Zhi-qiang2, LIU Zeng-shan1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun,Jilin,130062,China;2.ShandongBinzhouAnimalScienceandVeterinaryMedicineAcademy,Binzhou,Shandong,256600,China;3.ShandongLvduBio-SciencesandTechnologyCo.Ltd.,Binzhou,Shandong,256600,China)

Abstract:In order to find and identify the pathogen in the duck farm,enrich the molecular epidemiology of the pathogen and lay the foundation for the research on the new type of diagnostic reagent and vaccine.The clinical symptoms and pathological lesions were observed,the duck embryo passages were used to isolate the virus,and one step RT-PCR and sequence analysis were used to ultimately determine the pathogen.The result showed that the duck farm occurred duck hepatitis,pathogen was duck astrovirus.The duck astrovirus infection reports is not many,but is indeed lead to one of the pathogens of duck hepatitis,which should arouse the attention.

Key words:Duck astrovirus;Duck viral hepatitis;isolation; identification

文章编号:1007-5038(2016)03-0038-04

中图分类号:S858.32

文献标识码:A

作者简介：刘吉山(1975-)，男，山东高唐人，副研究员，博士研究生，主要从事动物疫病防控技术研究*通讯作者

基金项目：山东省优秀中青年科学家科研奖励基金项目(BS2011SW026)

收稿日期：2015-10-14