土茯苓中落新妇苷含量测定方法改进的研究

刘东平，廖启元，刘娱姗

（安徽中医药高等专科学校药学系，安徽芜湖 241000）

土茯苓中落新妇苷含量测定方法改进的研究

刘东平，廖启元，刘娱姗

（安徽中医药高等专科学校药学系，安徽芜湖 241000）

目的：改进15版《中国药典》收载的土茯苓中落新妇苷含量测定方法。方法：以60%甲醇为溶剂，分别用回流法、超声提取法制备供试品溶液，其余色谱条件同药典进行测定。结果：60%甲醇溶液超声提取法测定落新妇苷含量较60%甲醇溶液回流提取法更高。结论：采用改进后的测定方法能够真实反映土茯苓中落新妇苷含量，有利于对单味土茯苓及复方中的质量控制。

土茯苓；落新妇苷；含量测定；HLPC

土茯苓为百合科植物光叶菝葜 （Smilar glabra Roxb）的干燥根茎[1],主要分布于华东及西南地区,具有除湿、解毒、通利关节等作用,临床上主要用于治疗钩端螺旋体病以及用于镇痛,利尿,保肝等[2-3]。2010版《中国药典》及2015版《中国药典》中含量测定方法相同[1]，供试品溶液的制备方法圴为60%甲醇为溶剂加热回流提取。有文献显示[4]，测定目标成分落新妇苷（2R,3R）存在新落新妇苷（2S,3S）、异落新妇苷（2R,3S）及新异落新妇苷（2S,3R）三种异构体。作者在含量测定研究过程中发现，随着加热回流提取时间增加，土茯苓中落新妇苷含量会下降，而其它3种二氢黄酮类含量在上升，与正常延长提取时间，提取更完全的情况相反，而在以往的相关文献[5]中并没有对供试品制备过程中的加热过程进行研究。因此，本文对供试品溶液的制备方法进行了进一步研究，选择以60%甲醇为溶剂，采用中国药典最常见的提取方法超声提取法制备供试品溶液 （常用浸渍法和渗漉法提取效率差、有效成分提取不完全，60%甲醇溶剂不适宜用煎煮法），其余色谱条件同药典进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 仪器

DIONEX U3000型高效液相色谱仪（DAD检测器）（美国，戴安）；色谱柱：依利特 hypersil C18（5 um，4.6mm×250 mm）；万分之一（BSA224S型）及十万分之一（CPA225D）电子天平（瑞士，Sartorius）；KQ-250DB型数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；98-1-C型数字控温电热套（天津泰斯特仪器有限公司）。

1.1.2 溶剂

除甲醇为色谱纯、水为超纯水外，其余试剂均为分析纯。

1.1.3 标准品

落新妇苷（中国食品药品检定研究院，批号：111 798-201 303），提取物新落新妇苷、异落新妇苷、新异落新妇苷由上海中药标准化研究中心提供。

1.1.4 土茯苓

购自合肥和义堂中药饮片有限公司 （批号：20 150 101）。经安徽中医药高等专科学校中药教研室赵宝林教授鉴定为百合科植物光叶菝葜（smilaxglabra roxb）的干燥根茎。

1.2 方法

1.2.1 对照品与供试品溶液的制备

1.2.1.1 对照品溶液的制备

分别精密称取经五氧化二磷干燥24 h的落新妇苷对照品12.45 mg，置25 mL量瓶中,用60%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含498.0 ug的溶液。取新落新妇苷、异落新妇苷、新异落新妇苷提取物适量，加60%甲醇制成每1 mL约含0.4 mg的溶液，作为色谱定性鉴别。

1.2.1.2 60%甲醇加热回流提取供试品溶液的制备

取土茯苓粉末（过3号筛）约0.5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入60%甲醇100 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤纸滤过，取续滤液用0.22 um微孔滤膜过滤，即得。

1.2.1.3 60%甲醇超声提取供试品溶液的制备

取土茯苓粉末（过3号筛）约0.5 g，精密称定，置三角锥瓶中，精密加入60%甲醇100 mL，称定重量，超声提取1 h（暂定），放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤纸滤过，取续滤液用0.22 um微孔滤膜过滤，即得。

1.2.2 色谱条件

HPLC设备：DIONEX U3000高效液相色谱仪；DAD检测器；色谱柱：依利特hypersil C18；流动相：甲醇-0.1%冰醋酸溶液（39∶61）；检测波长：291 nm；流速：1 mL/min；进样体积：10 μL。

1.2.3 方法学考察

1.2.3.1 线性关系

精密量取落新妇苷对照品溶液 （498.0 μg/mL）0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL分别至 10 mL量瓶中，用60%甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成24.9，49.8，99.6,149.4，249.0 μg/mL的一系列对照品溶液，精密吸取上述溶液10 μL进样,按“1.2.2”项下色谱条件测定,以峰面积（S）为横坐标,对照品进样量（C,μg）为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程: S=55433 C+192147,r=0.9999，落新妇苷在24.9～249.0 mg范围内峰面积（S）与浓度（C）呈良好的线性关系。

1.2.3.2 精密度

精密吸取质量浓度为149.4 μg/mL的落新妇苷对照品溶液20 μL,按“1.2.2”项下色谱条件连续进样测定6次,记录色谱峰面积值，所得 RSD= 0.13%,表明仪器精密度均良好。

1.2.3.3 重复性

取同一样品,按“1.2.1.3”项下的方法平行制备6份供试品溶液,按“1.2.2”项下色谱条件测定,测定落新妇苷峰面积值,结果RSD为1.47%,表明该种测定方法重复性均良好。

1.2.3.4 加样回收率

精密称取落新妇苷对照品适量，加60%甲醇制成浓度为512 ug/mL落新妇苷对照品溶液，精密量取1 mL，分别加入到5份同一批样品中，按“1.2.1.3”方法制备5份供试品溶液，按“1.2.2”项下色谱条件的条件测定。结果加样回收率为99.4%,RSD为1.21%，说明具有良好的加样回收率。

1.2.4 测定法

分别吸取落新妇苷对照品溶液，新落新妇苷、异落新妇苷、新异落新妇苷提取物溶液，60%甲醇回流提取供度品溶液及60%甲醇超声提取供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪，测定，即得。新落新妇苷提取物、落新妇苷对照品、新异落新妇苷提取物、异落新妇苷提取物，60%甲醇回流提取供试品及60%甲醇超声提取供试品色谱图分别见下面图1～6。

图1 新落新妇苷提取物溶液色谱图

图2 落新妇苷对照品溶液色谱图

图3 新异落新妇苷提取物溶液色谱图

图4 异落新妇苷提取物溶液色谱图

图5 60%甲醇回流提取供试品色谱图

图6 60%甲醇超声提取供试品色谱图

2 结果

2.1 峰分析

关于土茯苓中二氢黄酮醇类成分已经有具体的研究[4-5]，其主要有效成分是落新妇苷及其异构体。根据图1中新落新妇苷提取物的位置、图2中落新妇苷对照品的位置、图3中新异落新妇苷提取物的位置、图4中异落新妇苷提取物的位置以及文献[5]中的图谱比较得出图5和图6中1号色谱峰，2号色谱峰、3号色谱峰、4号色谱峰分别代表新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷。根据文献[4]推断峰5号色谱峰代表的化合物是（2R，3R）-花旗松素-3’-o-β-D-吡喃葡萄糖苷，但有待进一步确认。

2.2 二氢黄酮醇类各成分峰面积变化

在对色谱峰面积的研究中发现，从表1中看出加热回流提取物中落新妇苷（2R,3R）及异落新妇苷（2R,3S）峰面积减少，而新落新妇苷（2S,3S）、新异落新妇苷（2S,3R）峰面积增加（注：以下表中各峰面积均为双样双针平均值折算0.5 g土茯苓的峰面积，RSD分别为1.63%,1.76%）。而加热回流提取与超声提的落新妇苷及其三个异构体即峰1、峰2、峰3、峰4的峰面积之和基本相同，说明加热过程中，不同的对映异构体会相互转化。

表1 回流提取法与超声提取法供试品各个峰面积变化

2.3 含量

批号20150101土茯苓按回流提取法落新妇苷含量为1.09%，按超声提取法落新妇苷含量为1.58%。结果表明，按超声提取法制备供试品溶液测定土茯苓中落新妇苷含量较回流提取法高。

2.4 超声提取法制备供试品溶液的提取时间研究

按1.2.1.3方法，分别超声15 min、30 min、45 min、60 min制备供试品溶液，注入液相色谱仪测定，结果如表2。显示超声30 min及以上时间土茯苓中落新妇苷含量基本不变，30 min已提出98.10%，因此，可将超声时间定为30 min。（注：以下各峰面积均为双样双针平均值折算0.5 g土茯苓的峰面积，RDS =1.35%）。

表2 测得茯苓中落新妇苷含量与提取时间关系

3 讨论

从试验过程中看，土茯苓中落新妇苷及其三个异构体在加热过程中会有转化，但转化为异构体之间的转化，4个异构体的总体含量在加热前后基本不变。因此，在对单味土茯苓及复方中的质量控制过程中，建议用60%甲醇溶液超声提取30 min测定落新妇苷单独含量和四个异构体总体含量，才能比较好的把控该品质量。落新妇苷及其三个异构体药理及毒理作用是否一致还是有较大区别，还未有文献进行研究，值得深入探究。

1.国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:化学工业出版社，2015:14.

2.江苏新医学院.中药大辞典:上册[M].上海:上海科学技术出版社，1986:91-93.

3.袁曙光.高耀风重用土茯苓治疗顽固性头痛45例观察[J].河北中医,1988,10（6）:4-5.

4.袁久志，窦德强，陈英杰，等.土茯苓二氢黄酮醇类成分研究[J].中国中药杂志，2004,29（9）:867-870.

5.贾玮,刘海,王峥涛.测定土茯苓中二氢黄酮醇类含量的UPLC法和HPLC法的建立与比较[J].中国药科大学学报，2004,40（4）:337-341.

6.王永奇,付晓雪,宋明明，等.落新妇苷及其异构体和同系物药源植物的研究进展 [J].华西药学杂志，2014,29（4）:463-466.

（2015-12-18收稿）

Optimization of the method for analyzing the amount of astilbin in Smilax glabra

Liu Dongping,Liao Qiyuan,Liu Yushan Department of Pharmacy of Anhui College of Traditional Chinese Medicine,Wuhu 241000,Anhui Province,China

Objective：To improve the methed of aualyze the amount of astilbin in Smilax glabra,which listed in the 15th edition of the Chinese Pharmacopoeia was optimized.Methods：Using 60%methanol as solvent, the sample solution was prepared by reflux method,and followed by ultrasonic extraction,and the amount of astilbin was determined by chromatography as instructed in the Pharmacopoeia.Results:Using 60%methanol solution,the amount of astilbin obtained by ultrasonic extraction was higher than by refluxing extraction. Conclusion：The optimized extraction method can accurately measure the actual amount of astilbin in Smilax glabra,which provides a better quality control in analyzing the amount of astilbin in single or compound Smilax glabra.

milax glabra;Astilbin;Content determination;HLPC

R283.3

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.02.008

刘东平（1978-），男，讲师,硕士。E-mail:liudongping588@163.com