红景天苷对人乳腺癌MDA-MB-435细胞功能的作用*

龚 舒，段承刚，陶忠桦，刘晓燕，傅俊江，甘 淋

（西南医科大学:1病理生理学教研室；2公共卫生学院；3医学基础研究中心；4生物化学教研室，四川泸州 646000）

红景天苷对人乳腺癌MDA-MB-435
细胞功能的作用*

龚 舒1，段承刚1，陶忠桦2，刘晓燕3，傅俊江3，甘 淋4

（西南医科大学:1病理生理学教研室；2公共卫生学院；3医学基础研究中心；4生物化学教研室，四川泸州 646000）

目的：通过检测红景天苷对人乳腺癌MDA-MB-435细胞的增殖、凋亡、周期及运动侵袭的影响，探讨红景天苷抗人乳腺癌的作用。方法：体外培养MDA-MB-435细胞，CCK-8法筛查红景天苷对细胞的半数有效抑制浓度（IC50）。以不加红景天苷组为对照组，以IC50浓度的红景天苷组为实验组，在光镜下观察其形态改变，CCK-8法检测细胞增殖抑制率，流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期，Transwell小室模型观察细胞运动和侵袭能力的改变。结果：红景天苷对人乳腺癌MDA-MB-435细胞的IC50为4 mg/mL；光镜下见红景天苷组细胞呈现坏死和凋亡形态；CCK-8法显示红景天苷组在作用24 h、48 h和72 h三个时间点均能抑制细胞的生长增殖，抑制率均高于对照组，且具有显著的时间-效应依赖性（P＜0.05）；流式细胞术显示红景天苷组早期凋亡率为（3.31±0.21）%、晚期凋亡和坏死率为（28.80±2.15）%，高于对照组（1.26±0.13）%和（5.56±0.78）%，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；细胞周期检测发现红景天苷组细胞较对照组在G0/G1期的比例增加，停滞在S期的比例减少，G2/M期的比例减少；运动实验结果显示，红景天苷作用72 h后，红景天苷组每个视野跨膜细胞数为（39.60±3.37）个，远低于对照组（142.20±12.99）个，差异具有统计学意义（P＜0.01）；侵袭实验结果示红景天苷组每个视野跨膜细胞数为（4.20±1.55）个，也低于对照组（13.00±3.09）个，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论：4 mg/mL红景天苷作用人乳腺癌MDA-MB-435细胞，可抑制生长增殖、诱导细胞凋亡和坏死发生、阻滞细胞周期、有效抑制肿瘤细胞的运动和侵袭。

红景天苷；乳腺癌；增殖；凋亡；侵袭

乳腺癌是女性最为多发的恶性肿瘤之一，近年的发病率与死亡率有显著上升[1]。红景天含有40多种化合物，其中红景天苷（Salidrosied，Sal）是迄今研究最多的有效成分之一[2]，已证明具有抗缺氧、抗疲劳、抗辐射、抗紫外线、抗病毒及对神经、内分泌系统的双向调节作用[3]。最近研究发现，多个品种红景天具有抗肿瘤作用[4]，其机理可能为抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞分化和凋亡、阻滞细胞周期、抑制肿瘤新生血管生成等。故本研究从细胞水平出发，采用分子生物学实验方法，研究红景天苷对高侵袭的人乳腺癌MDA-MB-435细胞的增殖、凋亡、周期和运动侵袭能力的作用。

1 材料与仪器

1.1 细胞株

人乳腺癌细胞株（MDA-MB-435）由美国贝勒医学院徐建明教授馈赠，西南医科大学医学基础研究中心保存。

1.2 药物与试剂

红景天苷（Sal）购自郑州丰耀农业科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒购自日本同仁化学研究所；细胞DNA含量检测试剂盒和Annexinv-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司。

1.3 主要仪器

二氧化碳培养箱、酶标仪（美国Thermo公司）；正置荧光显微镜（德国Leica公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；Transwell小室（美国Corning公司）。

2 方 法

2.1 红景天苷溶液的配制

蒸馏水5 mL高温灭菌，将1 g/瓶的红景天苷粉剂配制成浓度为200 mg/mL的溶液，正压滤过除菌，-20℃储存备用，用时现配。

2.2 半数有效抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）的筛查和计算

调整细胞密度至5×104个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL。24 h后，以不加红景天苷的细胞为对照组，以不同浓度（0.01 mg/mL、0.1 mg/mL、1 mg/ mL、10 mg/mL、100 mg/mL）红景天苷作用的细胞为实验组（Sal组），每组设4个平行孔。24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液,培养1 h后，置于酶标仪波长450 nm处测出各孔的吸光度（OD）值。改良寇式法公式计算半数有效抑制浓度lg（IC 50）=Xm-I [P-（3-Pm-Pn）/4]。此IC 50用于后续的红景天苷实验组浓度。

2.3 CCK-8法检测红景天苷对细胞增殖的影响

调整细胞密度至5×104个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL。24 h后加入红景天苷，实验组和对照组均设4个平行孔，分别培养24 h、48 h和72 h。各个时间点时在每孔加入10 μL的CCK-8溶液,培养1 h后，置于酶标仪波长450 nm处测出各孔的吸光度（OD）值。计算药物对细胞生长抑制率（IR）=（1-加药组OD值/空白对照组OD值）×100%。

2.4 流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡和周期

2.4.1 细胞凋亡检测

调整细胞密度至1×105个/mL，24 h后加入红景天苷。作用24 h后，2 000 r/min离心收集细胞并调整密度至1×106个/mL。加Binding Buffer 500 μL悬浮细胞，再依次加入Annexin V-FITC、Propidium Iodide各5 μL混匀。置室温避光反应10 min后上机检测细胞凋亡。

2.4.2 细胞周期检测

同2.4.1离心收集细胞，冰乙醇固定，调整密度至1×106个/mL。每管加含0.5%EDTA、100 μg/mL RNaseA的PBS液1 mL，37℃水浴30 min。通过200目筛网过滤，加入PI染色剂至终浓度50 μg/ mL，避光孵育10 min后上机检测细胞周期。

2.5 细胞运动、侵袭实验

2.5.1 细胞运动实验

调整细胞密度至1×106个/mL。加200 μL细胞悬液至Transwell侵袭小室的上室中，在下室中加入600 μL含20%FBS的培养基。培养72 h后取出上室，经甲醇固定、结晶紫染色，显微镜下成像和计数细胞。

2.5.2 细胞侵袭实验

4℃溶解Matrigel基质胶，用预冷的不含FBS的培养基稀释Matrigel基质胶至200 μg/mL。在侵袭小室的上室中每孔加入100 μL的稀释基质胶，置培养箱4 h后，余步骤同2.5.1。

2.6 数据分析

表1 红景天苷对人乳腺癌MDA-MB-435细胞的IC50筛查（,n=4）

表1 红景天苷对人乳腺癌MDA-MB-435细胞的IC50筛查（,n=4）

组别对照组Sal组浓度（mg/mL）0 0.01 0.1 1 10 100 OD值0.92±0.23 0.97±0.16 0.91±0.28 0.85±0.19 0.27±0.01 0.19±0.02抑制率（%）0 -5.21±2.83 1.83±4.85 8.14±3.19 70.45±0.12 79.78±0.24

3 结 果

图1 红景天苷对人乳腺癌MDA-MB-435细胞的IC50筛查曲线

图2 两组人乳腺癌MDA-MB-435细胞形态对比（×100）

3.1 红景天苷对人乳腺癌MDA-MB-435细胞的半数有效抑制浓度（IC50）筛查

用改良寇式法算出红景天苷对MDA-MB-435细胞的IC50为4 mg/mL。以细胞抑制率为纵坐标、红景天苷浓度为横坐标作标准曲线，可见红景天苷对MDA-MB-435细胞的IC50约为4 mg/mL，同改良寇式法公式计算结果一致。当红景天苷终浓度≤0.1 mg/mL时，抑制率呈负数，提示其可轻度促进MDA-MB-435细胞增殖。当红景天苷终浓度＞0.1 mg/mL以上，抑制率随药物浓度增大而升高 （见表1、图1）。

3.2 红景天苷作用人乳腺癌MDA-MB-435细胞的细胞形态改变

光镜下见对照组细胞贴壁生长、分布均匀、形态饱满、无色透明、折光性好。红景天苷组（4 mg/mL）见大部分细胞的体积变小、皱缩变圆、形态不典型、与邻近细胞分离、失去贴壁特性，呈现增殖抑制作用与细胞坏死和凋亡特征（见图2）。3.3 CCK-8比色法观察红景天苷对人乳腺癌MDAMB-435细胞增殖的影响

CCK-8检测表明，红景天苷对MDA-MB-435细胞的增殖有抑制作用。与对照组比较，红景天苷组抑制率随时间增加而上升。以细胞抑制率为纵坐标、红景天苷作用时间为横坐标作标准曲线显示，4 mg/ mL的红景天苷作用时间越长，细胞抑制率上升越明显，各时间点组别差异有统计学意义（F=36.73，P＜0.05）。红景天苷对MDA-MB-435细胞的抑制作用具有显著的时间-效应依赖关系（见表2、图3）。

表2 红景天苷对人乳腺癌MDA-MB-435细胞增殖的抑制作用（,n=4）

表2 红景天苷对人乳腺癌MDA-MB-435细胞增殖的抑制作用（,n=4）

注：a与对照组相比，P＜0.05

组别对照组Sal组抑制率（%）24 h 0 30.08±4.94a48 h 0 38.95±2.58a72 h 0 45.01±12.13a

3.4 红景天苷诱导人乳腺癌MDA-MB-435细胞凋亡

流式检测显示：红景天苷组（4 mg/mL）早期凋亡率为（3.31±0.21）%，晚期凋亡和坏死率为（28.80± 2.15）%，高于对照组的早期凋亡率（1.26±0.13）%、晚期凋亡和坏死率（5.56±0.78）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。可见在红景天苷干预下，诱导细胞早期凋亡、晚期凋亡和坏死的作用增强（见图4）。

图3 不同时间点红景天苷对人乳腺癌MDA-MB-435细胞增殖的抑制曲线

图4 两组人乳腺癌MDA-MB-435细胞的细胞凋亡情况

3.5 红景天苷影响人乳腺癌MDA-MB-435细胞周期

流式检测显示，与对照组比较，红景天苷对MDA-MB-435细胞周期分布有影响，差异有统计学意义（P＜0.05）。红景天苷可致MDA-MB-435细胞的G0/G1期延长，停滞在S期的比例减少，在G2/M期的比例减少（见图5，表3）。

图5 两组人乳腺癌MDA-MB-435细胞的细胞周期检测

表3 红景天苷影响人乳腺癌MDA-MB-435细胞的细胞周期分布（，n=4）

表3 红景天苷影响人乳腺癌MDA-MB-435细胞的细胞周期分布（，n=4）

组别对照组Sal组t P G0/G1（%）36.11±4.32 53.09±3.64 4.98＜0.05 S（%）54.44±5.12 42.59±2.59 5.18＜0.05 G2/M（%）9.46±2.47 4.32±0.73 4.81＜0.05

Transwell法结果显示，在24 h和48 h时间点，细胞运动和侵袭差异均不明显。作用72 h后，红景天苷组MDA-MB-435细胞的运动和侵袭能力较对照组显著降低。红景天苷组运动和侵袭实验中每个视野跨膜细胞数分别为（39.60±3.37）个和（4.20± 1.55）个，显著低于对照组运动与侵袭实验的（142.20 ±12.99）个和（13.00±3.09）个，差异有统计学意义（P＜0.05，见图6，表4）。

图6 红景天苷抑制人乳腺癌MDA-MB-435细胞运动与侵袭能力情况

表4 Transwell法检测红景天苷对人乳腺癌MDA-MB-435细胞的运动与侵袭能力（，n=4）

表4 Transwell法检测红景天苷对人乳腺癌MDA-MB-435细胞的运动与侵袭能力（，n=4）

组别对照组Sal组t P细胞运动142.20±12.99 39.60±3.37 14.37＜0.01细胞侵袭13.00±3.09 4.20±1.55 5.32＜0.05

4 讨 论

中医认为，正虚邪实是乳腺癌发病的总病机，组方原则以健脾益气为主，以软坚散结、疏肝理气、清热解毒为佐[5]。因化学合成药物的毒副作用和耐药性，筛选天然药物作为治疗肿瘤的候选和辅助药物成为研究热点[6]。抗癌中药对乳腺癌细胞的杀伤作用，可通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡、遏制细胞迁移、逆转细胞耐药性以及干扰基因表达等多种途径实现，具有广大的应用前景[7]。文献证实[8]，红景天苷对乳腺癌的生长及癌细胞的转移均有有效抑制作用，具有潜在的临床药用开发价值。Hu等[9]认为红景天苷对多种肿瘤细胞生长均有抑制，是由于红景天苷通过上调细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子-p27Kip1与p21Cip1的表达，下调细胞周期蛋白依赖激酶CDK4和Cdc2的表达，抑制细胞周期蛋白D1和B1的表达，进而抑制细胞周期蛋白依赖激酶CDK4/细胞周期蛋白D1的相关通路，阻滞癌细胞周期于G1期；抑制细胞周期蛋白依赖激酶Cdc2/细胞周期蛋白B1通路，阻滞癌细胞周期于G2期。虽然目前研究提示红景天苷可能对乳腺癌治疗有一定作用，但其调

3.6 红景天苷抑制人乳腺癌MDA-MB-435细胞的运动侵袭控癌细胞增殖、凋亡、周期和运动侵袭的详细机制尚不清楚。本课题组就红景天苷的上述作用做出初步研究，结果发现，4 mg/mL红景天苷作用人乳腺癌MDA-MB-435细胞，可抑制其生长增殖、诱导细胞凋亡和坏死发生、阻滞细胞周期、有效抑制肿瘤细胞的运动和侵袭，为下一步探讨红景天苷成为抗乳腺癌靶点药物的分子机制提供了实验基础。

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（2015-09-15收稿）

Effect of Salidroside on the function of human breast cancer cell line MDA-MB-435

Gong Shu1，Duan Chenggang1，Tao Zhonghua2，Liu Xiaoyan3，Fu Junjiang3，GanLin41Department of Pathophysiology;2Department of Epidemiology and Statistics of School of Public Health;3The Research Center for Preclinical Medicine;4Department of Biochemistry,Southwest Medical University,Luzhou 646000，Sichuan Province,China

Objective：To explore the effects and mechanisms of Salidroside on human breast cancer.Human breast cancer cell line MDA-MB-435 was treated with Salidroside（Sal）,and cell proliferation,apoptosis，cell migration and invasion were evaluated.Methods：The MDA-MB-435 cells were cultured in vitro.The half maximal inhibitory concentration（IC50）of Salidroside on MDA-MB-435 cells was determined by CCK-8 assay. MDA-MB-435 cells treated with IC50 of Sal were considered as the Sal group,and cells without Sal treatment were as the control group.Cell morphology was observed using light microscope，cell proliferation was detected by CCK-8 assay，apoptosis and cell cycle were evaluated by flow cytometry，and cell migration and invasion were studied using Transwell assay.Results:The IC50 of Sal on human breast cancer MDA-MB-435 cells was 4 mg/mL.The cells treated with Sal showed the typical morphology of necrosis and apoptosis under lightmicroscropy.Using CCK-8 assay,cells proliferation was significantly inhibited at the IC50 of Sal at 24 h,48 h and 72 h,relative to the control group（P＜0.05）,and the inhibition showed a time-dependent manner.Flow cytometry using AnnexinⅤ-FITC/PI apoptosis assay kit demonstrated that the percentage of early apoptotic cells was significantly increased（3.31±0.21）%in the Sal group,compared to（1.26±0.13）%in the control group（P＜0.05）,and the late apoptosis and necrosis was also significantly induced （28.80±2.15）%in the Sal group, compared to （5.56±0.78）%in the control group（P＜0.01）.The results of FITC demonstrated that the ratio of G0/G1 was increased,while the cells at S phase and the ratio of G2/M were decreased compared to those of the control group.The cell migration and invasion assay revealed that the average number of invaded and migrated cells in the Sal group in migration assay（39.60±3.37）,and in invasive assay（4.20±1.55）were significantly decreased compared to the control group in migration assay（142.20±12.99） （P＜0.01）and in invasive assay（13.00 ± 3.09）（P ＜ 0.05）,respectively.Conclusion：Salidroside treatment significantly inhibited cell proliferation,and promoted apoptosis,arrested cell cycle and repressed the motility and invasion of MDA-MB-435 cells.

Salidroside;Breast cancer;Proliferation;Apoptosis;Invasion

R737.9

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.02.003

*四川省科技厅应用基础研究计划项目（14JC0155）

龚 舒（1982-），女，硕士。

甘 淋（1976-），女，副教授，博士。E-mail：gl-gump@163.com