葡萄糖氧化酶在畜牧业中的应用及检测方法研究进展

■熊云霞　马现永　胡友军　王　丽　郑春田

(广东省农业科学院动物科学研究所农业部华南动物营养与饲料重点实验室国家畜禽育种重点实验室广东省动物育种与营养公共实验室广东省畜禽育种与营养研究重点实验室,广东广州510640）



葡萄糖氧化酶在畜牧业中的应用及检测方法研究进展

■熊云霞马现永胡友军王丽郑春田

(广东省农业科学院动物科学研究所农业部华南动物营养与饲料重点实验室国家畜禽育种重点实验室
广东省动物育种与营养公共实验室广东省畜禽育种与营养研究重点实验室,广东广州510640）

摘要：葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOD）作为一种绿色环保饲料添加剂，能改善饲料质量、改善动物肠道微生态平衡、提高饲料利用率、促进动物生长，在饲料中应用可一定程度取代抗生素的使用。文中主要综述了GOD的理化和酶学特性、GOD的功能及其在畜牧养殖业中的应用、酶活检测方法的原理及应用研究进展，并对各检测方法的优缺点进行了比较。

关键词：葡萄糖氧化酶；饲料添加剂；酶活检测方法

近年来，抗菌素类添加剂在畜牧业中发挥巨大作用，但是其药物残留和耐药性问题也日益凸显。葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）作为一种绿色环保饲料添加剂，具有无残留、无污染的特点[1]，可减缓饲料氧化变质、改善动物肠道微生态平衡、提高饲料利用率、促进动物生长、降低中毒反应，预防动物肠道感染、腹泻，在一定程度上可起到类似于抗生素、酸化剂和益生菌的作用[2-12]。本文主要综述了GOD的理化和酶学性质、GOD在畜牧养殖业中的应用及功能、酶活检测方法的原理及其应用研究进展，并对各检测方法的优缺点进行了比较。

1 GOD的理化及酶学性质

GOD是β-D-吡喃型葡萄糖需氧脱氢酶的简称，其系统名称叫β-D-葡萄糖∶氧1-氧化还原酶。GOD酶液为黄色至棕色液体，高纯度GOD为淡黄色晶状粉末。不同来源GOD的分子量介于130~175 kDa之间（多为150 kDa左右），最高可达186 kDa（源自黑曲霉）[13]。GOD易溶于水，不溶于有机溶剂，最大光吸收波长为377 nm和455 nm。在紫外光下无荧光，但在热、酸或碱处理后具有特殊的绿色。

GOD是由相同糖蛋白经二硫键共价结合而成的同型二聚体，每个糖蛋白单体含有2个区域：其中一个活性区域以非共价的β-折叠的形式与部分辅基FAD紧密结合，辅基FAD在该酶促反应过程中发挥关键作用；另一个活性区域以4个α-螺旋支撑1个反向平行的β-折叠形式与底物β-D-葡萄糖结合。来源于P.amagasakiense的GOD活性位点关键氨基酸残基有Tyr -73、Phe-418、Trp-430、Arg-516、Asn-518、His-520和His-563[14]，其中Arg-516和Asn-518是GOD和其底物β-D-葡萄糖异性结合最关键氨基酸，有芳香族残基的Tyr-73、Phe-418和Typ-430对于催化正确的反应方向及葡萄糖氧化的最大速率非常重要，而His-520和His-563在反应过程中与底物葡萄糖的1-OH形成氢键（如图1）。

图1 GOD辅基FAD和主要活性位点三维结构[13]

GOD的作用原理是：在有氧环境下氧化β-D-葡萄糖C-1氧化生成D-葡萄糖酸-δ-内酯，并产生过氧化氢；然后，过氧化氢酶将过氧化氢分解生成水和氧；最后，水与D-葡萄糖酸-δ-内酯结合产生葡萄糖酸[13]（如图2）。影响其活性的因素主要有温度、pH值和供氧量。GOD活性对温度变化比较敏感，不同来源GOD的最适反应温度不同，来源于P.funiculosum433 的GOD的最适反应温度为25~30℃[15]，来源于P.amaga⁃sakiense ATCC 28686的最适温度为40~60℃[16-17]。不同来源的GOD的动力学参数Km、Vmax相差也比较大。pH值在3.5~6.5酶活比较稳定，最适pH值为5.0~ 5.6，此范围内酶活基本不变。GOD半衰期在37℃时为30 min左右，固定化后酶活性更高，固定酶制剂在2~8℃条件下可稳定保存1年,在-15℃下可稳定保存8年。在底物浓度比较低时，酶反应速率随底物浓度增高而加快；在底物浓度较高时，底物浓度对酶反应的影响不大，葡萄糖浓度在5%~20%，反应速率几乎不变。Ag+、Hg+、亚硫酸氢钠对酶有强烈的抑制作用，而Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+对酶有不同程度的激活作用。

图2 GOD反应原理[14]

2 GOD的功能及在畜牧业上应用

GOD广泛地分布于动物、植物和微生物体内，但由于微生物具有来源广、生长繁殖速度快等特点，故其成为GOD的主要来源，目前主要生产菌株为青霉和黑曲霉[18- 19]。欧盟和美国早已将产自黑曲霉的GOD列入允许动物饲料中使用的酶制剂范围，1999年我国将产自青霉的GOD规定为允许使用的饲料级酶制剂之一，2013年我国农业部限定特异青霉和黑曲霉为允许使用的饲料级GOD生产菌株，这大大增加了GOD的来源，为拓宽GOD的应用范围提供了保障。

2.1 GOD在畜牧业上的应用

GOD作为一种饲用酶制剂广泛应用于动物养殖中，目前的研究主要集中于仔猪、肉鸡和蛋鸡、家兔养殖等,在反刍动物、水产、家蚕养殖上也有一定应用[20]。

2.1.1 GOD在仔猪生产上的应用

大量研究表明，日粮中添加适量GOD可以显著提高仔猪日粮能量、蛋白质、脂肪和纤维消化率，改善断奶仔猪肠道健康，明显改善生产性能和健康水平。张宏宇等[21]在评价GOD对断奶仔猪生长性能的影响时发现，断奶仔猪饲粮中添加200 mg/kg的GOD可显著提高断奶仔猪的生长性能、降低腹泻率以及改善养殖经济效益。安文亭等[22]在商品猪（杜×长×大）健康仔猪中添加GOD，可显著提高仔猪日粮能量、蛋白质、脂肪和纤维消化率（P<0.05），生产性能和健康水平，GOD在仔猪日粮中的适宜添加量为30 U/kg。杨久仙等[23-24]的研究进一步发现，饲粮中添加0.1%~0.2%的GOD能够降低断奶仔猪胃肠道pH值，改善肠道形态结构，提高营养物质消化率和饲料转化效率，提高氮利用效率，促进机体营养物质的合成，从而提高断奶仔猪日增重。汤海鸥等[25-26]研究显示，仔猪日粮中添加适量GOD可有效提高日增重、采食量，改善料肉比，有效改善仔猪肠道健康，提高血清中相关激素含量；GOD组仔猪粪便中沙门氏菌数显著低于对照组(P<0.05)；GOD组三碘甲状腺原氨酸、甲状腺素和生长激素含量显著高于对照组(P<0.05)。

2.1.2 GOD在家禽生产上的应用

GOD在家禽中的应用主要集中在肉鸡和蛋鸡，对于其在种鸡中的应用也有一定的研究。庞家满等[27]研究表明，GOD对37~70日龄黄羽肉鸡的日增重、料重比和养分代谢率有显著影响，以添加380 g/t GOD最适宜。贡筱等[28]发现，在日粮中添加不同剂量复合酶能提高肉鸡生长性能。宋海彬等[29-31]在肉鸡日粮中添加GOD，一方面提高肉鸡十二指肠和空肠绒毛高度、降低隐窝深度、增加绒毛高度/隐窝深度（V/C），显著提高肉鸡小肠淀粉酶、胰蛋白酶的活性（P<0.05）；另一方面，促进肉鸡蛋白质的合成代谢、提高免疫机能，GOD提高了肉鸡胸腺、脾脏、法氏囊指数，显著提高了肉鸡血清IgG水平和血清球蛋白水平，不同程度地提高了肉鸡血清超氧化物歧化酶水平，降低了血清丙二醛水平，具有一定的抗氧化和抗应激的作用。张晓云[32]和赵国先等[33-36]对蛋鸡的研究表明，蛋鸡饲粮中添加GOD,加强了蛋鸡体内蛋白质的合成代谢,提高了蛋鸡的产蛋性能，降低了破(软)蛋率，显著提高了饲料转化率，提高生产性能和经济效益，且饲粮中添加GOD对改善鸡蛋品质有一定的作用，添加0.4% GOD能极显著降低蛋黄中胆固醇含量(P<0.01)。徐海燕[37]发现，日粮中添加一定量的GOD可以显著降低种鸡的死淘率。GOD还可以与其他添加剂配伍使用。孙春阳等[38]发现，饲喂添加葡萄糖氧化酶和酵母硒的复合添加剂的白羽肉鸡日粮可提高肉鸡生长性能、抗氧化性能，改善肉品质。

2.1.3 GOD在家兔生产上的应用

吴艳芳等[39]研究表明，GOD对断奶仔兔的生产性能有一定促进作用，对照组饲喂基础饲粮，试验组添加不同剂量的GOD，各组间的采食量均无显著差异(P>0.05)。GOD添加0.2%、0.3%组的日增重和料肉比与对照组相比差异显著(P<0.05)。

2.2 GOD的功能

2.2.1改善饲料质量，减缓饲料氧化变质

GOD和过氧化氢酶构建的氧化还原体系在消耗氧气的同时，生成过氧化氢，使得GOD在饲料中可以用作抗氧化剂和防霉剂。氧气的消耗抑制了细菌生长，减少了饲料营养的损失；过氧化氢的产生可抑制霉菌，降低霉菌毒素的含量，从而达到改善饲料质量、延长饲料保质期的效果。

2.2.2消除肠道病原菌生存环境，保持肠道菌群生态平衡

GOD催化肠道内的葡萄糖产生葡萄糖酸和过氧化氢，此过程消耗肠道内的氧气而形成厌氧环境，利于厌氧有益菌的增殖生长，形成微生态竞争优势，从而抑制大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌存活；生成的葡萄糖酸可在一定程度上降低肠道内的pH值，为乳酸菌的生长创造酸性环境，使得有益菌大量增殖；反应生成的过氧化氢具有灭菌作用，可直接抑制多种有害菌如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡萄球菌、弧菌等的生长繁殖，从而降低有害菌的感染。在上述的多重作用下，饲料中添加GOD可增强动物机体免疫力。杨久仙等[24]研究表明，与对照组相比，日粮中添加0.2%和0.3%GOD可以显著降低仔猪胃和回肠大肠杆菌数量(P<0.05)，增加仔猪胃和回肠乳酸菌数量(P<0.05)。赵艳姣等[40]研究发现，GOD能够缓解霉变日粮对小鼠平均日增重的影响，不同浓度的GOD显著或极显著减少了肠道大肠杆菌数量（P<0.05或P< 0.01），极显著提高了肠道乳酸杆菌数量（P<0.01）,而且随着饲喂时间的延长，效果更好。汤海鸥等[41]采用常规的牛津杯抑菌试验方法进行GOD体外抑菌实验表明，GOD有较明显的产酸效果和对大肠杆菌和沙门氏菌较好的抑制效果。

2.2.3保护肠道上皮细胞完整，抵御病原体感染

GOD具有良好的抗氧化作用，在动物体内可以有效清除自由基，保护肠道上皮细胞完整，阻挡大量病原体的侵入，添加GOD保护肠道上皮细胞完整,使球虫侵入肠道上皮寄生部位的机会大大降低。宋海彬等[30]研究了GOD对肉鸡肠道形态结构的影响，结果表明，日粮中添加GOD可提高肉鸡十二指肠和空肠绒毛高度、增加绒毛高度/隐窝深度（V/C）。

2.2.4改善肠道酸性消化环境，促进动物生长

如上所述，GOD可显著改善动物肠道的微生态环境和保持肠道完整性，提高机体免疫力；同时，生成的葡萄糖酸可降低胃肠道pH值，促进肠胃蠕动，有利于保持各种消化酶活性，有助于提高饲料消化率，因而促生长作用明显。宋海彬等[30]研究表明，GOD显著提高肉鸡小肠淀粉酶、胰蛋白酶的活性（P<0.05）。GOD可改善饲料的适口性,添加GOD可以使拒食、厌食、消化不良、腹泻的动物迅速恢复正常采食。

2.2.5降低中毒反应

GOD一方面可直接抑制黄曲霉、黑根霉、青霉等多种霉菌,另一方面通过消化道进入解毒器官肝脏，一定程度上加速毒性成分的代谢，降低动物霉菌毒素中毒和药物中毒反应。崔亚利等[42]研究霉变饲粮中添加GOD对小鼠血清指标和肝脏结构与功能的影响发现，含有30%霉变玉米面的饲料中添加0.3%~0.5% 的GOD可以改善霉变饲料对肝脏造成的病理损伤，增强肝脏的抗氧化能力和蛋白质代谢功能。霉变饲料中添加GOD可以缓解对动物肝脏造成的慢性毒性作用。

3 GOD的检测方法研究进展

随着GOD在畜牧业应用的日益增多，如何评价及准确测定酶活成为GOD研究的一个热点。目前，基于不同的酶活定义而建立的检测方法有很多，主要传统方法有如电化学法、测压法、凝胶电泳法、滴定法[43]、分光光度法等，比较新型的方法有傅里叶变换红外光谱法[44]、生物传感器法[45]等。各种检测方法及其优缺点比较如下。

3.1电化学法

电化学法是根据酶促反应中电压或电流的变化来测量GOD活性。在研究GOD活性初期建立的，基于电化学法原理的氧电极法、简易电化学法和自动电化学法，具有较好的灵敏度和重复性，但对操作人员和仪器的要求均很高，随着研究深入和检测技术的发展，滴定法和分光光度法等操作更为简便的方法建立后，该类方法已很少使用。

3.2测压法

测压法是通过使用瓦勃氏仪测定GOD的酶促反应中所消耗的氧量来确定GOD的活性。该方法的操作复杂，要求严格，对仪器依赖很强，在应用中存在一定难度，因此未能被推广使用。

3.3凝胶电泳法

凝胶电泳法是通过显示电泳分离后特定的酶分子所处的凝胶区域完成酶的检测。GOD反应的初级产物——过氧化氢不易检测，故在反应混合物中可补充过氧化氢酶作为辅助酶完成酶偶联反应。根据反应原理和检测对象不同，凝胶电泳法可分为显色法（以D-葡萄糖酸为检测物）和荧光法（以过氧化氢为检测物）。荧光法可以检测含量低于10- 3U/ml的 GOD，灵敏度高。但是该方法操作复杂，结果易受到其他物质的干扰，且反应的试剂不易获得。

3.4滴定法

滴定法基本原理是以过量的NaOH溶液终止GOD酶促反应并中和生成葡萄糖酸，再以标准盐酸溶液反滴,计算得到生成的葡萄糖酸的量，进而推算出GOD的活性。滴定法GOD的酶活定义为：在pH值5.6，温度为30℃的条件下，每分钟催化1 μmol葡萄糖转化为葡萄糖酸和过氧化氢所需的酶量。滴定法测定GOD酶活，酶活力在1.125~5.321 U/ml时线性关系较好。滴定法具有简便易行、试剂要求低和成本低的优势，非常适用于一般生产和研究，但同时也存在着工作量大、样品需要量大尤其是人工读数导致的误差大、测量灵敏度低的缺点，不便于检测方法的标准化开发。

3.5分光光度法

由于方便易操作，分光光度法是目前使用较为广泛的酶活测定方法。分光光度法测定GOD的原理是，GOD在有氧条件下将葡萄糖氧化为δ-葡萄糖基-内酯和过氧化氢，生成的过氧化氢在有过氧化酶存在的条件下氧化供体，再根据形成的氧化性供体特性，通过分光光度计在不同波长处进行检测。根据实际应用，分光光度法又分为连续分光光度法和普通分光光度法。

3.5.1连续分光光度法

目前，关于GOD活性检测的分光光度法的研究报导多使用连续分光光度法。该法的酶活定义为：在pH值7.0，温度为25℃（或37℃）的条件下，每分钟催化葡萄糖氧化，转化产生1 μmol葡萄糖酸和过氧化氢所需的葡萄糖氧化酶的量。常见的供体有4-氨基安替比林+苯酚和邻-联二茴香胺，其中以4-氨基安替比林和苯酚为供体测定时，反应温度为37℃，测量波长为500 nm；以邻-联二茴香胺为供体测定时，反应温度为25℃，测量波长为436 nm。连续分光光度法需要连续测定相同间隔（30 s或1 min）的吸光度，再用线性回归计算，过程较为复杂，对操作人员的技能有较高要求，在一定程度上会降低实用性。李丕武等[46]对分光光度法进行改进，在0.044~0.351 U/ml范围内，用两点法代替标准方法进行测定。

3.5.2普通分光光度法

普通分光光度法原理与连续法类似，该方法GOD酶活定义为：在pH值5.6，温度为30℃的条件下，每分钟催化葡萄糖氧化，转化产生1 μmol葡萄糖酸和过氧化氢所需的葡萄糖氧化酶的量即为一个GOD酶活性单位（U）。供体采用2，2-连氮基-双-（乙基苯基噻唑啉）-6-磺酸盐（ABTS-R），ABTS氧化生成蓝绿色产物在420 nm处有特异吸收峰。类似此法的靛蓝胭脂红褪色分光光度法[47]，在测定GOD活性时需要绘制GOD标准曲线，且测定过程中样品需要定容，相对于连续法中直接向比色皿中加样增加了操作步骤，但避免连续法的繁琐的稀释操作，且对于反应时间准确性的要求不高。

连续分光光度法比较于普通分光光度法精密度更高，避免因为测定时间的不同造成的结果误差。且该方法操作简单，可以作为进一步进行检测方法标准化的主要选择对象，可实现微孔快速高通量自动化检测。

3.6傅里叶变换红外光谱法

傅里叶变换红外光谱法是后来开发的一种检测GOD酶活的方法，该方法的原理是：D-葡萄糖酸-δ-内酯由于C=O伸缩振动在最大带1 212 cm-1处的振幅强度可以作为一个时间函数来研究葡萄糖氧化动力学过程，葡萄糖酸-δ-内酯的消光系数为1.28 mM-1cm-1，反应的初始速度和酶浓度是呈比例的，且通过双倒数作图法得到的动力学常数和基于水相中辣根过氧化物酶偶联的分光光度法所得到的动力学常数一致，证明该方法的可靠性。傅里叶变换红外光谱法测定GOD活力，优势是检测速度快、底物用量少，对酶质量要求不高，可以测定来自青霉和黑曲霉发酵的去菌体酶提取液或纯化的酶制剂，并且可以对酶活进行在线实时检测，但该法对仪器要求高，且模型建立所需要的前期投入太大，因此大大限制了它的使用。

3.7生物传感器法

任婷月等[45]采用SBA-40C型生物传感分析仪，利用生物传感分析仪检测葡萄糖质量浓度的工作原理，GOD专一性地与β-D-葡萄糖反应，产生的过氧化氢在过氧化氢电极表面上发生电子转移，内置电子元件将电信号转变为数字信号，用已知活性单位的GOD作为测定标准定标后，即可在仪器上直接测出待测样品的GOD活性单位。利用生物传感分析仪测定GOD活力时，缓冲液最佳pH值为6.5，测定时间20 s，操作周期小于60 s，连续10次测定RSD值为0.63%，0~ 100 U/ml的范围内线性良好，r=0.999 1。且该方法与滴定法测定结果比较发现，两方法结果相差不大。该方法专一性高、简便、快速、准确、重复性好，适用于样品数目较多的GOD活力的快速测定，但对仪器依赖性强。

4讨论与结语

如上所述，GOD在畜禽生产中的应用已有较多报道，GOD能够显著改善饲料质量、改善动物肠道微生态平衡、提高饲料利用率、促进动物生长、提高蛋鸡生产性能和蛋品质，但是对于其作用机理的研究相对缺乏，在动物体内的作用方式、作用条件、代谢过程有待进一步明确。不同生理阶段动物实际生产中的适宜添加量还有待进一步研究。GOD已有的活性测定方法较多，但是GOD产品标准和GOD活性的测定方法标准的缺乏限制了其在饲料工业中的应用。测定GOD的各种方法中，分光光度法因其操作简单方便，对仪器要求不高，可以作为进一步进行检测方法标准化的主要选择对象。随着GOD发酵工艺、制备提纯工艺不断发展完善，生产技术日趋成熟，绿色养殖概念的逐渐深入，GOD将在畜牧养殖业中发挥越来越重要的作用。

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（编辑：刘占，laramie_liu@139.com）

Application progress of glucose oxidase in stock breeding industry and research of the enzyme activity assay method

Xiong Yunxia, Ma Xianyong, Hu Youjun, Wang Li, Zheng Chuntian

Abstract：Glucose oxidase is a kind of green feed additive, which can improve the feed quality, keep balance of animal intestinal micro ecology, improve the efficiency of feed utilization, promote the growth of animals, and it can be used to replace antibiotics in feed. This article mainly summarized the physical and chemical properties of GOD, the function of GOD and its application in animal breed⁃ing, the principle and assays of the enzyme activity detection, and it compared the advantages and dis⁃advantages of each method.

Key words：glucose oxidase；feed additive；enzyme activity assay method

收稿日期：2015-12-21

通讯作者：马现永，研究员。

作者简介：熊云霞，硕士，研究方向为家禽营养与饲料。

中图分类号：Q55

文献标识码：A

文章编号：1001-991X（2016）04-0015-06

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.04.004