饲料中添加枯草芽孢杆菌对方斑东风螺稚螺生长、肌肉组成与免疫功能的影响

■冼健安陈　江张秀霞方　哲黄丹枫王冬梅

（1.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口571101；2.华中农业大学水产学院，湖北武汉430070）



饲料中添加枯草芽孢杆菌对方斑东风螺稚螺生长、肌肉组成与免疫功能的影响

■冼健安1陈江2张秀霞1方哲1黄丹枫2王冬梅1

（1.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口571101；2.华中农业大学水产学院，湖北武汉430070）

摘要：为探讨饲料中添加枯草芽孢杆菌对方斑东风螺稚螺生长、肌肉组成与免疫功能的影响，在基础饲料中添加3个不同浓度（2.34×105、2.34×107CFU/100 g和2.34×109CFU/100 g）的枯草芽孢杆菌，养殖初始体重为0.62 g的方斑东风螺10周。结果显示，与对照组相比，添加枯草芽孢杆菌浓度为2.34×109CFU/100 g时，增重率和特定生长率有显著的提高（P<0.05），增重率相对对照组提高了11.4%；与对照组相比，试验组的脏体比、肥满度、存活率、肌肉体组成没有显著性差异（P>0.05）；添加枯草芽孢杆菌对过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽还原酶（GR）活力没有显著影响（P>0.05）；添加浓度为2.34×105CFU/100 g时，东风螺肝胰腺的超氧化物歧化酶（SOD）活力提高17.8%（P<0.05）；添加浓度为2.34×109CFU/100 g时，碱性磷酸酶（AKP）活力提高61.9%（P<0.05），而添加浓度为2.34×107和2.34× 109CFU/100 g时，酸性磷酸酶（ACP）活力分别提高28.9%和94.6%（P<0.05）。这些结果表明，饲料中添加2.34×109CFU/100 g的枯草芽孢杆菌可显著提高方斑东风螺稚螺的生长性能和部分非特异性免疫功能。

关键词：方斑东风螺；枯草芽孢杆菌；配合饲料；免疫

Effects of dietary Bacillussubtilison growth performance, muscle composition and immunity of Babyloniaareolata

Xian Jian’an, Chen Jiang, Zhang Xiuxia, Fang Zhe, Huang Danfeng, Wang Dongmei

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Key words：Babyloniaareolata；Bacillussubtilis；compound feed；immunity

方斑东风螺（Babyloniaareolata）味道鲜美、营养价值高，随着人工育苗和养殖技术的成功，我国东南沿海以及越南、泰国等东南亚国家兴起了养殖东风螺的热潮，东风螺养殖业发展前景良好[1]。但目前东风螺的养殖仍主要以冰鲜鱼为饵料，存在饵料供应不稳定、残饵不易清理、养殖水体污染严重、病原大量滋生等问题，直接制约了东风螺养殖的规模化、可持续化发展。研制污染小、营养全面以及可增强免疫力的专用配合饲料代替冰鲜鱼，是东风螺养殖业健康、可持续发展的重要保障。近年来，东风螺营养需求的研究已相继开展[2-7]，但其配合饲料仍有待进一步的优化。

益生菌已作为饲料添加剂广泛应用于水产动物配合饲料中，研究表明，饲料中添加一定含量的益生菌可提高水产动物的饲料转化率、促进生长、增强免疫力[8-9]。在过往的研究中，本研究组针对两种芽孢杆菌对方斑东风螺免疫力的影响进行了初探，发现枯草芽孢杆菌能显著提高方斑东风螺的免疫功能，而地衣芽孢杆菌则表现出免疫抑制作用[10]。为进一步探明枯草芽孢杆菌的作用，本试验研究了不同添加量枯草芽孢杆菌对方斑东风螺的生长性能、肌肉组分以及免疫功能的影响，为枯草芽孢杆菌在东风螺饲料中的合理应用提供参考。

1材料和方法

1.1饲料配制

本饲料是以鱼粉为主要的蛋白源，α-淀粉为主要糖源，鱼油为主要脂肪源配制试验所需要的基础饲料，基础饲料组成及营养水平见表1。枯草芽孢杆菌菌粉（细菌含量为1.17×1010CFU/g）由中国热带农业科学研究院热带生物技术研究所提供。不添加枯草芽孢杆菌的基础饲料组为对照组，试验组在基础饲料中分别添加三个不同浓度的枯草芽孢杆菌：2.34×105、2.34×107CFU/100 g和2.34×109CFU/100 g。各原料粉碎后过80目筛，然后按照配方称取原料，用饲料混合机混合均匀，再加入鱼油以及含有不同浓度枯草芽孢杆菌的水，混合揉成面团状软颗粒饲料，按照估算的日投喂量小份分装，置于-20℃冰箱保存，投喂前解冻至室温。

表1基础饲料组成及营养水平(%)

1.2养殖管理

养殖试验于2014年6月~8月在海南省琼海市长坡镇椰林村某方斑东风螺养殖场内进行。方斑东风螺稚螺由该养殖场提供，选取同一批螺苗，暂养在30 cm×40 cm×35 cm规格的塑料箱中，用基础饲料驯养两周。挑选活力好、规格相近的个体作为试验稚螺，随机分配至各组中，每组3个重复。箱子底部铺上3~4 cm厚的沙子，海水进行过滤后用作试验用水，盐度30‰~31‰，水温(27±2)℃，流水养殖。饲料日投喂量为螺重的4%~5%，并根据实际摄食情况进行调整，每天19:00投喂。养殖周期为10周。

1.3样品采集与指标测定

东风螺取样前禁食24 h，统计存活率（SR）后，称量终末体重（FBW），计算试验方斑东风螺的增重率（WGR）、特定生长率（SGR）和饲料系数（FC）。东风螺放入液氮中速冻，运至实验室置于-80℃冰箱保存。

1.3.1生长性能

增重率（weight gain rate，WGR，%）=100×（螺终末平均体重-螺初始平均体重）/螺初始平均体重；

特定生长率（specific growth rate，SGR，%/d）= 100×（Ln螺终末平均体重-Ln螺初始平均体重）/饲养天数；

肉壳比=螺肉的质量(g)/螺壳的质量(g)；

存活率（survival rate，SR，%）=100×试验结束时螺的颗数/开始时螺的颗数；

脏体比（viscerosomic index，VSI，%）=100×内脏团重(g)/螺体重(g)；

肥满度（condition factor，CF）=肉重(g)/螺体重(g)。

1.3.2饲料和肌肉营养组成

用105℃烘箱干燥法测定饲料和螺肌肉的水分（GB/T 6435—1986）；将烘干的饲料和螺肌肉组织粉碎，用凯氏定氮法测定饲料和螺肌肉的粗蛋白含量（GB/T 6432—1994）；用索氏抽提法测定饲料和螺肌肉的粗脂肪含量（GB/T 6433—1994）；采用550℃灼烧法测定灰分含量（GB/T 6438—1992）。

1.3.3免疫酶活性

每个重复各随机选取3只螺，每饲料组共9只，每只螺的组织单独测定。在-80℃冰箱取出样品，待适当解冻后，于冰上解剖分离出肝胰脏，用4℃的生理盐水冲洗，用吸水纸将水吸干，准确称取组织重量，按重量体积比加入9倍的生理盐水制成10%的组织匀浆，4℃、2 500 r/min离心10 min，取上清液用于酶活测定。组织匀浆粗提液蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）、碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性测定采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行。

1.4统计分析

结果用“平均值±标准差（Mean±SD）”表示，利用SPSS19.0对试验结果进行单因素方差分析（One-way ANOVA），P<0.05确认为差异显著。

2　结果

2.1枯草芽孢杆菌对方斑东风螺生长性能和肌肉组成的影响（见表2~表3）

表2饲料中添加枯草芽孢杆菌对方斑东风螺生长性能的影响

表3饲料中添加枯草芽孢杆菌对方斑东风螺肌肉组成的影响（%）

饲料中添加2.34×109CFU/100 g的枯草芽孢杆菌显著提高了螺的增重率和特定生长率（P<0.05），增重率相对对照组提高了11.4%。与对照组相比，饲料中添加枯草芽孢杆菌对螺的肥满度、肉壳比、脏体比和存活率均没有显著影响（P>0.05）。如表3所示，饲料中添加枯草芽孢杆菌对方斑东风螺肌肉的水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量没有显著影响（P> 0.05）。

2.2枯草芽孢杆菌对方斑东风螺免疫功能的影响（见表4）

结果如表4所示，与对照组相比，饲料中添加浓度为2.34×105CFU/100 g的枯草芽孢杆菌使东风螺肝胰腺SOD活力提高17.8%（P<0.05）；饲料中添加枯草芽孢杆菌对CAT和GR活力没有显著影响（P>0.05）；饲料中添加2.34×109CFU/100 g的枯草芽孢杆菌使东风螺的AKP活力提高61.9%（P<0.05）；添加浓度为2.34×107CFU/100 g和2.34×109CFU/100 g时，ACP活力分别提高28.9%和94.6%（P<0.05）。

3　讨论

3.1枯草芽孢杆菌对方斑东风螺生长性能的影响

表4饲料中添加枯草芽孢杆菌对方斑东风螺免疫功能的影响

芽孢杆菌广泛存在于自然界中，是目前使用最为广泛的益生菌种类之一，具有安全、稳定、不产生抗药性、无毒害残留等优点，是抗生素的绝佳替代品[9]。其中，枯草芽孢杆菌是我国农业部允许直接投喂动物的微生物添加剂，在目前水产养殖中最为常用的芽孢杆菌。以往的研究已表明，饲料中添加各类芽孢杆菌能够提高斑点叉尾鮰（IetalurusPunetaus）、黑鲷（Acan⁃thopagrus schlegelii）、杂交鲟（Acipenser baeri♂× Acipenserschrenkii♀）、奥尼罗非鱼（Oreochromisni⁃loticus×O. aureus）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）、青鱼（Mylopharyngodonpiceus）、异育银鲫（allogynoge⁃neticcruciancarp）以及凡纳滨对虾（Litopenaeusvan⁃namei）等的生长性能[11-20]。一般认为，芽孢杆菌能够定植在动物肠道内，产生维生素、氨基酸、促生长因子等多种营养物质，并且产生多种酶类，提高动物体的消化酶活力，参与胃肠道的代谢过程，提高饲料中营养物质的消化吸收率，从而促进动物的生长[8]。也有报道显示，枯草芽孢杆菌可以通过改善草鱼肠道黏膜形态，促进其对饲料的吸收利用，从而促进其生长[12]。在本研究中，添加枯草芽孢杆菌浓度为2.34×109CFU/100 g时，增重率和特定生长率也有显著提高，与上述研究结果一致，表明枯草芽孢杆菌可以作为饲料添加剂应用于方斑东风螺稚螺的配合饲料中，可有效促进方斑东风螺的生长性能。但也有研究显示，饲料中添加0.03%~0.18%的枯草芽孢杆菌对吉富罗非鱼（Oreo⁃chromis niloticus）的生长性能没有显著影响[21]，添加0.2%的芽孢杆菌使网箱养殖鲤（Cryprinuscarpiod）的增重率和饲料利用率下降[22]。造成这些研究结果的差异，可能与养殖动物品种差异、芽孢杆菌菌种差异、芽孢杆菌对试验动物肠道以及水体环境的适应性等有关。

饲料中添加枯草芽孢杆菌对水产动物形体指标影响的结果也存在一定的差异。随着枯草芽孢杆菌添加量的提高，斑点叉尾鮰的肠体比和肝体比都出现先增加后降低的趋势，添加组的肥满度都低于对照组，但差异不显著[11]。饲料中添加枯草芽孢杆菌对草鱼的肥满度、体质量体长比、脏体比均没有显著影响，仅2 000 mg/kg组鱼的肝体比显著大于对照组[23]。饲料添加枯草芽孢杆菌对黑鲷的肝体指数没有显著影响[13]。本研究结果显示，饲料中添加枯草芽孢杆菌后，方斑东风螺的肥满度、肉壳比、脏体比均没有显著变化，表明在基础饲料的营养成分已能满足东风螺正常生长需要的情况下，其可食用部分，即肌肉部分的比例较为恒定，不受枯草芽孢杆菌添加的影响。枯草芽孢杆菌对形体指标的影响可能与试验动物以及菌种的差异有较大关系。

3.2枯草芽孢杆菌对方斑东风螺肌肉组成的影响

斑点叉尾鮰的研究结果显示，在饲料中添加300、500 mg/kg和700 mg/kg的枯草芽孢杆菌可使鱼肌肉中粗蛋白质与对照组相比分别提高了6.62%、11.00% 和10.36%[11]。但另外一些研究显示，饲料中添加枯草芽孢杆菌对体组成没有显著影响。摄食添加枯草芽孢杆菌的饲料的青鱼鱼种与对照组青鱼鱼种相比，其全鱼营养组成均无显著差异[17]。饲料中添加枯草芽孢杆菌对黑鲷幼鱼全鱼和肌肉组成均没有显著影响[13]。在本研究中也发现，饲料中添加枯草芽孢杆菌对方斑东风螺稚螺肌肉组成没有显著影响。

3.3枯草芽孢杆菌对方斑东风螺免疫功能的影响

众多研究已显示，枯草芽孢杆菌作为饲料添加剂可在一定程度上提高水产动物的免疫功能和抗氧化活力。投喂添加枯草芽孢杆菌饲料的黑鲷幼鱼血清总蛋白水平，及CAT、SOD活性显著提高，肝脏谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性也显著提高[13]。克氏原螯虾（Procambarusclarkii）血细胞吞噬活性于投喂枯草芽孢杆菌后第7 d开始显著高于对照组，溶菌活力、抗菌活力也显著提高[24]。在饲料中添加0.25%枯草芽孢杆菌可显著提高杂交鲟的血清溶菌酶、AKP、SOD活力及总抗氧化能力(T-AOC)[14]。然而，一些研究也发现，枯草芽孢杆菌对不同的免疫指标也有不同的作用效果。饲料中添加枯草芽孢杆菌可显著提高凡纳滨对虾血清ACP和酚氧化物酶（PO）活力，而对血清SOD和过氧化物酶（POD）活力没有显著影响[18]。投喂添加枯草芽孢杆菌饲料的草鱼血清中免疫球蛋白M、补体C3含量和AKP活性，血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白含量，白球比以及溶菌酶和谷草转氨酶（GOT）活性无显著变化，血清和肝胰脏中T-AOC、CAT、SOD活力以及肝胰脏中还原型谷胱甘肽（GSH）含量显著升高[25]。在本研究组前期的研究中也发现，饲料中添加0.5%的枯草芽孢杆菌对东风螺肝胰腺SOD和CAT活力没有显著影响，而显著提高POD活力[10]。在本研究中，低浓度（2.34×105CFU/100 g）的枯草芽孢杆菌可显著提高东风螺肝胰腺SOD活力，3个浓度的枯草芽孢杆菌均对CAT和GR活力没有显著影响，最高浓度（2.34×109CFU/100 g）则显著提高AKP和ACP活力。综合生长性能指标来看，在方斑东风螺饲料中添加本研究所用的枯草芽孢杆菌菌粉，其浓度以2.34× 109CFU/100 g为宜。

枯草芽孢杆菌对水产动物免疫功能和抗氧化活力的影响也可能受到养殖动物、菌种以及环境条件的差异等各类因素的影响。总体而言，枯草芽孢杆菌对水产动物生长和免疫的作用机理是多方面的，各方面相互影响，且由于养殖对象自身特性的差异，应用效果和适宜添加量也就有所差别。通过试验筛选适合某种水产动物使用的高效菌种，并确定其适宜的添加范围是目前最直接有效的途径。

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（编辑：刘占，laramie_liu@139.com）

基金项目：海南省重点科技计划项目[ZDXM20130047]；中国热带农业科学院热带生物技术研究所基本科研业务费专项资金[ITBB2015ZY01；ITBB2015ZD03]

收稿日期：2015-11-10

通讯作者：王冬梅，研究员。

作者简介：冼健安，博士，助理研究员，研究方向为水产动物营养与饲料学、水产养殖生态及毒理学。

中图分类号：S816.7

文献标识码：A

文章编号：1001-991X（2016）04-0005-05

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.04.002