菠萝蛋白酶在饲料上的研究进展及应用前景

■王修启　梁少杰　周加义　高春起　严会超

（华南农业大学动物科学学院，广东广州510642）



菠萝蛋白酶在饲料上的研究进展及应用前景

■王修启梁少杰周加义高春起严会超

（华南农业大学动物科学学院，广东广州510642）

[编者按]菠萝蛋白酶是一种植物蛋白酶，能够将饲料中的蛋白质转化成易于动物吸收的多肽和小肽，提高饲料的转化率，从而减轻养殖对环境的污染。菠萝蛋白酶对致病菌引起的腹泻也有一定的治疗效果，避免抗生素带来的负面影响，改善动物的生长性能，抵御寄生虫对动物的伤害；并且生产菠萝蛋白酶的资源丰富，具有大力开发和利用的潜能，是一种理想的抗生素替代型饲料添加剂。本期特邀华南农业大学王修启研究员就菠萝蛋白酶的研究现状与应用所面临的问题进行阐述，并对其发展前景进行了展望。

摘要：我国是菠萝的生产大国，产量常年位居世界前列。但是对菠萝的应用却比较局限，主要是用作水果供人们食用。而菠萝皮、菠萝冠以及菠萝茎叶中的有效成分——菠萝蛋白酶却被浪费。菠萝蛋白酶具有抗菌消炎和改善动物生长性能的作用，是一种潜在的抗生素替代物。然而，由于过高的制取成本及苛刻的保存条件等因素制约，限制了其在饲料工业上的应用。文章就菠萝蛋白酶的研究现状及应用所面临的问题进行阐述，并对其发展前景进行了展望。

关键词：菠萝蛋白酶；饲料添加剂；应用

近年来，畜牧业面临的环境问题越来越严峻，人们对畜产品安全的关注度日益增加。菠萝蛋白酶是一种植物蛋白酶，能够将饲料中的蛋白质转化成易于动物消化吸收的多肽和小肽，提高饲料的转化效率从而减轻对环境的污染。菠萝蛋白酶能够治疗某些致病菌引起的腹泻，且具有一定的抗菌能力，与抗生素一起使用能够增强疗效，减少抗生素使用；同时，使动物的免疫和抗病能力有所提升[1-3]。与抗生素相比，菠萝蛋白酶的使用不会引起病原菌的耐药性，也没有残留问题。此外，菠萝蛋白酶还能够改善动物的生长性能，抵御寄生虫对动物的伤害，是一种具有广泛作用和广阔应用前景的饲料添加剂。本文综述菠萝蛋白酶在畜牧生产上的研究进展，探讨其在饲料工业上应用的可行性。

1菠萝蛋白酶的理化性质

菠萝蛋白酶可从菠萝果、茎、叶和皮等部位提取，主要分为果酶和茎酶。1891年Mercaro等首先用硫酸铵沉淀法从菠萝果实中分离出了果菠萝蛋白酶。He⁃inicke等(1957)[4]用丙酮沉淀法从菠萝茎中制取茎菠萝蛋白酶，从而使菠萝蛋白酶实现了商品化生产。Amid等[5]应用基因重组技术，生产出重组的果菠萝蛋白酶。但由于生物技术的限制，目前尚未开发出可高效表达菠萝蛋白酶的工程菌。因此，目前菠萝蛋白酶生产仍然使用以菠萝茎和菠萝果下脚料为原料的化学提取技术。

菠萝蛋白酶是一种混合酶，果肉中的菠萝蛋白酶，包括果菠萝蛋白酶A（FBA，Fruit BromelainA）和果菠萝蛋白酶B（FBB，Fruit Bromelain B）两种基本成分，菠萝茎中发现的菠萝蛋白酶含有9种有效成分F1~F9，其中F4和F5是主要的成分，F9的酶活性最强[6]。茎酶和果酶在结构上类似，均含有1个巯基和4个二硫键，它们同属于半胱氨酸蛋白水解酶类。不同品种的菠萝中含有的菠萝蛋白酶性质不同，菠萝蛋白酶作用的最适pH值为6.0~8.5,最适反应温度为50~60℃，茎酶的蛋白酶活性比果酶更强[7-9]。此外，与其他蛋白酶相类似，菠萝蛋白酶的活性还受到金属离子、EDTA和半胱氨酸盐酸盐等的影响[10]。通常，我们所使用的菠萝蛋白酶大多是指茎菠萝蛋白酶。

2菠萝蛋白酶应用于畜牧生产的优缺点

菠萝蛋白酶应用于畜牧生产有以下优点：①原料充足。菠萝在世界范围内的栽培量及产量都很可观，湛江市徐闻县每年产量就达40多万吨，占全国产量的三分之一。因此，将菠萝生产的下脚料以及菠萝根茎等用作菠萝蛋白酶生产的原料，可提高菠萝的利用率，产生更高的经济效益[3]。②活性高、抗逆性强，活力可达1.2×106U/g。菠萝蛋白酶具有较强的蛋白酶活性，有助于饲料中蛋白质的降解，从而提高饲料蛋白质的可消化性。同时，菠萝蛋白酶在消化道内能保持一定的活力，可经受胃酸和胃蛋白酶的作用，且在伴有碱性物质服用时的酶活力更强[11-12]。③提高抗病力。菠萝蛋白酶能够提高动物的免疫力，增强抗生素等药物的药效，降低人与动物患病的几率，减少对环境的压力，有助于生态和谐。④安全性高。菠萝蛋白酶安全性已受到时间的考验,其在医药及食品上的应用已有很长的历史,鲜见有关毒性的报道[13-14]。因此，菠萝蛋白酶在饲料工业上具有较高的应用价值和发展潜力。

菠萝蛋白酶虽然有上述的优点，但同时存在一些不足。①提取成本高，设备工艺复杂。②保存条件苛刻。作为一种生物活性成分，需要合适的温度、pH值等储存条件。有研究指出，果菠萝蛋白酶在-4℃条件下保存180 d后的存留活力降为原始活力的75%，之后再降低保存温度所得酶的活力与-4℃没有显著差异[15]。③原料产地限制。菠萝的产地多集中在亚热带地区，在我国产地主要是广东、广西和海南等省，限制了菠萝蛋白酶的应用范围。

综上，菠萝蛋白酶应用在饲料上最大的优势是原料充足、高效安全等，但将其广泛应用在饲料工业中尚需克服生产成本高、保存条件苛刻等问题。

3菠萝蛋白酶的提取工艺

目前，工业上运用比较成熟的主要有三种工艺，分别是高岭土吸附法、单宁沉淀法和超滤浓缩法。这三种方法各有优缺点，其中超滤浓缩法经过超滤浓缩、沉淀干燥得到酶制品，步骤较少且成本比较低，因而最具推广价值[16]。超滤浓缩液也可不经过化学物质的沉淀，直接使用高岭土吸附法获得纯度较高的酶制品。韩志萍等[17]用超滤法在压力（266±2）kPa，温度（12±0.5）℃，膜进口流速（21±0.2）ml/s下的酶活截留率预测值为88.45%。这种方法对果汁的酸糖度、微量元素等理化特性无不良影响，且生产的果汁透明澄清、芳香宜口，不影响果汁的生产。

菠萝蛋白酶的提取工艺日新月异，除了上述的方法外，聚丙烯酰胺结合磁性纳米氧化铁吸附技术[18]、双水相萃取技术[19]、乙醇沉淀法[20]和色谱法等方法相继被开发，其中的一些技术也已运用到实际生产中[21]。这些方法均能获得纯度与活性较高的酶制品，但因制备成本较高，限制了其在饲料工业上的使用。

4菠萝蛋白酶在畜牧生产上的研究与应用

4.1菠萝蛋白酶防治腹泻的研究

阳性产肠毒素大肠杆菌（K88+ETEC）是导致仔猪细菌性腹泻的重要因素。K88+ETEC的致病机理要依靠其附着到位于肠黏膜上的特定糖蛋白受体实现。体内和体外的研究均表明，菠萝蛋白酶可阻止K88+ETEC对仔猪小肠上皮的附着，达到预防和治疗腹泻的功效。Mynott等[22]在体外培养兔回肠段时加入菠萝蛋白酶，可显著降低大肠杆菌和霍乱弧菌的不利影响。进一步的研究证实，菠萝蛋白酶对毒素的缓解作用除了破坏细菌附着的受体之外，还可通过减缓毒素的促分泌作用来实现。Chandler等[23]研究表明，给仔猪连续10 d灌喂12.5 mg和125 mg的菠萝蛋白酶均可显著降低因K88+ETEC攻毒导致引起的仔猪腹泻率，同时增加仔猪的平均日增重。吴云桃[24]在日本大耳白仔兔上也得到了相类似的结果。

Roselli等[25]以肠道上皮细胞系（IPEC-1）为模型，用K88+ETEC攻毒并加入多种植物提取物进行筛选，发现菠萝蛋白酶等具有抵抗病原菌引起的肠道细胞膜损伤的功效。黄志坚等[26]通过构建用体外细胞黏附模型，研究了菠萝蛋白酶对K88+ETEC黏附大鼠小肠黏膜上皮细胞的抑制作用，结果表明，K88+ETEC细胞壁经菠萝蛋白酶水解作用1、2 h和3 h后，黏附小肠黏膜上皮细胞的能力较空白对照组分别降低31.79%、59.62%和68.15%，提示菠萝蛋白酶可显著降低K88+ETEC在小肠上皮的黏附率。

4.2菠萝蛋白酶在家禽生产中的应用

菠萝蛋白酶可显著提高其免疫能力和生长性能。李志华等[27]研究发现，在基础日粮中添加凤梨酵素复合酶（以菠萝蛋白酶为主）对华北柴鸡生产性能的改善效果优于单独添加盐霉素组。Lien等[28]研究表明，日粮添加500 U/kg的菠萝蛋白酶显著增加了蛋壳的厚度，同时增强了蛋鸡的免疫能力。Li等[29]在肉鸡日粮中添加0.05%菠萝蛋白酶可显著提高饲料营养物质消化率。

4.3菠萝蛋白酶在反刍动物上的应用

在奶牛和羊的饲料中添加菠萝蛋白酶，可提高乳品品质。也有研究表明，患有乳房炎的奶牛饲喂含有菠萝蛋白酶的日粮，可降低奶中的体细胞数。Contre⁃ras等[30]在奶山羊的日粮中加入185 mg/kg体重的菠萝蛋白酶，提高了乳脂率及乳蛋白含量，改善了乳品质，但对产奶量和乳腺感染情况没有显著影响。

寄生虫病是动物重要的疾病之一，对动物健康存在较大影响。使用化学杀虫剂进行杀灭会造成畜产品的残留问题；同时，寄生虫对药物的抵抗力也越来越强。菠萝蛋白酶可使多种寄生虫的角质层损坏，使成虫移动能力下降甚至死亡。Luciana等[31]研究表明，菠萝蛋白酶与微小牛蜱共培养，可显著降低其产卵和繁殖率。

4.4菠萝蛋白酶在水产动物上的应用

菠萝蛋白酶处理食物废渣作为鱼类的饲料，能够减少食物浪费，减轻环境压力。Choi等[32]研究表明，与商品鱼饲料相比，用1%与2%的菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合物处理食物残渣用作草鱼饲料，反而会提高草鱼的生长性能与免疫性能。

5应用前景展望

自欧盟禁止促生长抗生素的使用以来，国内禁止抗生素使用的声音不绝于耳。菠萝蛋白酶在饲料工业上有很大的应用潜力，但是也存在着不足，生产工艺的改进和生产成本的降低等方面的问题显得尤为迫切。随着基因工程技术的进步，将菠萝蛋白酶基因转入到原核或者真核生物中表达来获得高活性的菠萝蛋白酶的前景是可期的。基因工程技术具有较好解决菠萝蛋白酶生产效率低下、生产受到地域和季节限制等问题的潜力[33]。同时，在菠萝蛋白酶加工处理中，可通过包被和后喷涂等技术解决菠萝蛋白酶抗逆性差的问题。

除了作为饲料添加剂直接添加到饲料中外，也可使用菠萝蛋白酶水解产物作为饲料原料。唐旭等[34]在对菠萝蛋白酶酶解鱼鳞蛋白的研究中指出，温度为60℃，酶量4%，料液比5%，时间3 h的条件下水解度可以达到18.1%，同时降低了产品的不良风味，提高了产品的功能性小肽含量和产品的适口性。与菠萝蛋白酶同属于半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶，在投放到鱼塘后起到了改善水质的效果。这可能源于蛋白酶对加快了水池中蛋白及多肽等的降解作用，进而抑制病原微生物的生长[35]。菠萝蛋白酶具有清澈啤酒和红酒的效果，这与木瓜蛋白酶作用相类似，其是否能够改善鱼塘的水质及其发挥作用机理尚需要进一步研究。

6　结论

作为一种可改善日粮蛋白质消化率、动物抗病力和生产性能等的饲料添加剂，菠萝蛋白酶无疑为我国蛋白质饲料资源匮乏和畜禽蛋白质利用效率低下等问题的解决带来希望。然而，真正把菠萝蛋白酶广泛应用到饲料工业中仍然面临着一些问题，如在不同畜禽品种、不同生产阶段的最适添加量的确定，与其他饲料添加的配伍问题，产量低、价格高和产品抗逆性差等问题。随着菠萝蛋白酶研究的不断深入和生物技术的发展，诸多问题也将逐步被解决，其在畜禽日粮上的应用将更为普遍。

参考文献

[1] Dutta S, Bhattacharyya D. Enzymatic, antimicrobial and toxicity studies of the aqueous extract of Ananascomosus(pineapple) crown leaf[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2013,150(2):451-457.

[2] Praveen N C, Rajesh A, Madan M, et al. In vitro evaluation of an⁃tibacterial efficacy of pineapple extract (bromelain) on periodontal pathogens[J]. Journal of International Oral Health,2014,6(5):96-98.

[3] Hale L P. Proteolytic activity and immunogenicity of oral brome⁃lain within the gastrointestinal tract of mice[J]. International Im⁃munopharmacology, 2004, 4(2):255-264.

[4] Heinicke R M, Gortner W A. Stem bromelain—A new protease preparation from pineapple plants[J]. Economic Botany, 1957, 11 (3):225-234.

[5] Amid A, Ismail N A, Yusof F, et al. Expression, purification, and characterization of a recombinant stem bromelain from Ananasco⁃mosus[J]. Process Biochemistry, 2011, 46(12):2232-2239.

[6] Harrach T, Eckert K, Schulze-Forster K, et al. Isolation and par⁃tial characterization of basic proteinases from stem bromelain[J]. Journal of Protein Chemistry, 1995, 14(1):41-52.

[7] Corzo C A, Waliszewski K N, Welti-Chanes J. Pineapple fruit bro⁃melain affinity to different protein substrates[J]. Food Chemistry, 2012, 133(3):631-635.

[8] Polaina J, MacCabe P. Industrial enzymes：structure, function and applications[M]. Dordrecht: Springer, 2007: 184-185.

[9] Ketnawa S, Chaiwut P, Rawdkuen S. Pineapple wastes: A poten⁃tial source for bromelain extraction[J]. Food & Bioproducts Pro⁃cessing, 2012, 90(3):385-391.

[10]章佩芬,陈敏华,郭利平.菠萝蛋白酶应用的性质研究[J].现代食品科技, 2002, 18(2):16-17.

[11] Hale L P, Greer P K, Trinh C T, et al. Proteinase activity andstability of natural bromelain preparations.[J]. International Im⁃munopharmacology, 2005, 5(4):783-793.

[12] Hale L P, Fitzhugh D J, Staats H F. Oral immunogenicity of the plant proteinase bromelain[J]. International Immunopharmacolo⁃gy, 2007, 6(13/14):2038-2046.

[13] Braun J M, Schneider Bbeuth H J. Therapeutic use, efficiency and safety of the proteolytic pineapple enzyme Bromelain-POS in children with acute sinusitis in Germany[J]. Vivo, 2005, 19(2): 417-421.

[14] Rosenberg L, Barezovski A, Gurfinkel R, et al. Safety & efficacy of bromelain extract in debriding deep burns: Recent summary of all available data[J]. Burns, 2009, 35(Suppl 1):S17.

[15] Bhattacharya R, Bhattacharyya D. Preservation of natural stabili⁃ty of fruit“bromelain”from ananascomosus (pineapple)[J]. Jour⁃nal of Food Biochemistry, 2009, 33(1):1-19.

[16]王平诸,孙君社,李魁.菠萝蛋白酶三种生产工艺的比较[J].河南化工, 2002(7):1-3.

[17]韩志萍,黄茂芳,许逵,等.菠萝蛋白酶超滤提取工艺的响应面优化研究[J].广东农业科学, 2013, 40(6):103-107.

[18] Chen D H, Huang S H. Fast separation of bromelain by poly⁃acrylic acid-bound iron oxide magnetic nanoparticles[J]. Process Biochemistry, 2004, 39(12):2207-2211.

[19] Babu B R, Rastogi N K, Raghavarao K S M S. Liquid-liquid ex⁃traction of bromelain and polyphenol oxidase using aqueous twophase system[J]. Chemical Engineering & Processing, 2008, 47 (1):83-89.

[20] Soares P A G, Vaz A F M, Correia M T S, et al. Purification of bromelain from pineapple wastes by ethanol precipitation[J]. Sep⁃aration & Purification Technology, 2012, 98(39):389-395.

[21] Arshad Z I M, Amid A, Yusof F, et al. Bromelain: an overview of industrial application and purification strategies.[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2014, 98(17):7283-7297.

[22] Mynott T L, Guandalini S, Raimondi F, et al. Bromelain prevents secretion caused by Vibriocholeraeand Escherichiacoli entero⁃toxins in rabbit ileum in vitro[J]. Gastroenterology, 1997, 113(1): 175-184.

[23] Chandler D S, Mynott T L. Bromelain protects piglets from diar⁃rhoea caused by oral challenge with K88 positive enterotoxigenic Escherichiacoli.[J]. Gut, 1998, 43(2):196-202.

[24]吴云桃.菠萝蛋白酶对仔兔大肠杆菌腹泻的防治作用和促生长作用[D].中国农业大学, 2006.

[25] Roselli M, Britti M H L I, Marfaing H, et al. Effect of different plant extracts and natural substances (PENS) against membrane damage induced by enterotoxigenic Escherichia coli K88 in pig intestinal cells[J]. Toxicology in Vitro, 2007, 21(2):224-229.

[26]黄志坚,董瑞兰,罗刚,等.菠萝蛋白酶体外抑制小肠黏膜上皮细胞黏附K88+ETEC的作用[J].福建农林大学学报：自然科学版, 2014, 43(5):495-498.

[27]李志华,周淑亮,孙勇斌,等.凤梨酵素复合酶和溶菌酶对华北柴鸡生产性能的试验[J].饲料研究, 2009(4):4-6.

[28] Lien F, Cheng Y H, Wu C P, et al. Effects of supplemental bro⁃melain on egg production and quality, serum and liver traits of laying hens[J]. Journal of Animal Science Advances, 2012,2(4): 386-391.

[29] Li C Y, Lu J J, Wu C P, et al. Effects of probiotics and bremel⁃ain fermented soybean meal replacing fish meal on growth perfor⁃mance, nutrient retention and carcass traits of broilers[J]. Live⁃stock Science, 2014, 163(5):94-101.

[30] Contreras A, Paape M J, Miller R H, et al. Effect of bromelain on milk yield, milk composition and mammary health in dairy goats [J]. Tropical Animal Health & Production,2009,41(4):493-498.

[31] Luciana F D, Rodrigo G, Karina Alves F, et al. In vitro activity of pineapple extracts (Ananas comosus, Bromeliaceae) on Rhipi⁃cephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae)[J]. Experimen⁃tal Parasitology, 2013, 134(3):400-404.

[32] Choi W M, Lam C L, Mo W Y, et al. Upgrading food wastes by means of bromelain and papain to enhance growth and immunity of grass carp (Ctenopharyngodonidella) [J]. Environmental Sci⁃ence & Pollution Research, 2015:1-9.

[33] George S, Bhasker S, Madhav H, et al. Functional characteriza⁃tion of recombinant bromelain of Ananascomosus expressed in a prokaryotic system[J]. Molecular Biotechnology, 2014, 56(2):166-174.

[34]唐旭,施建臣,陈宇,等.菠萝蛋白酶酶解鱼鳞蛋白的工艺优化研究[J].食品工业科技, 2013(13):181-183.

[35] Wong M H, Tang L Y, Kwok F S. The use of enzyme-digested soybean residue for feeding common carp[J]. Biomedical & Envi⁃ronmental Sciences, 1997, 9(4):418-423.

（编辑：高雁，snowyan78@163.com）

Author

王修启，研究员，博士生导师，教授三级岗。南京农业大学农学博士，华南农业大学畜牧学博士后，美国Texas A & M University访问学者。曾任华南农业大学动物营养与饲料科学系副主任、学院实验教学中心主任。

主要从事分子营养学、功能性饲料添加剂与饲料资源开发、肉鸽产业化等方面的研究。“十二五”期间，主持NSFC-广东联合基金重点项目，合作承担国家自然科学基金重点项目，主持承担“973”项目子课题2项、“948”重点项目子课题1项、动物福利行业专项课题1项以及广东省科技计划和教育厅重点项目等科研课题。2011年以来发表SCI论文近20篇，主持完成广东省科技成果登记1项，授权专利3项。

Application prospect and overview of bromelain on feed

Wang Xiuqi, Liang Shaojie, Zhou Jiayi, Gao Chunqi, Yan Huichao

Abstract：China is one of the biggest pineapple producers in the world. However, most of the pineap⁃ples were served as fruit, the application of pineapple is relatively limited. The effective component bromelain in peel, crown, stem and leaves was wasted. The function of anti-microbia, diminishing in⁃flammation and improving growth performance makes bromelain a potential substitution for antibiotics. Whereas, the high cost of extraction and rigorous preservation conditions are two main limitations for the application of bromelain in feed industry. In this review, we exposit research situation and applica⁃tion problems of bromelain, and we preview its development prospect.

Key words：bromelain；feed additive；application

基金项目：广东省自然科学基金项目[2015A030310524]；广州市科技计划项目[201510010020]

收稿日期：2016-01-25

作者简介：王修启，研究员，博士生导师，研究方向为饲料资源开发与应用。

中图分类号：TQ925

文献标识码：A

文章编号：1001-991X（2016）04-0001-04

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.04.001