南美白对虾白便综合征病原霍乱弧菌的分离与药敏试验

曹海鹏，温乐夫，周桂娴，张　帆，何　珊*

(1. 上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306; 2. 上海市水产养殖工程技术研究中心，上海 201306; 3. 上海高校知识服务平台上海海洋大学水产动物遗传育种中心(ZF1206)，上海 201306)



南美白对虾白便综合征病原霍乱弧菌的分离与药敏试验

曹海鹏1,2,3，温乐夫1,2,3，周桂娴1,2,3，张帆1,3，何珊1,2,3*

(1. 上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306; 2. 上海市水产养殖工程技术研究中心，上海 201306; 3. 上海高校知识服务平台上海海洋大学水产动物遗传育种中心(ZF1206)，上海 201306)

摘要:为确定南美白对虾白便综合征的病原菌及其药物敏感性，采用传统方法从患白便综合征的南美白对虾肝胰腺中分离到病原菌菌株BB31，结合API 20E革兰阴性菌鉴定系统、16 S rDNA序列及聚类分析对菌株BB31进行了鉴定，并通过纸片琼脂扩散法对菌株BB31的药物敏感性进行了测定。结果表明，菌株BB31为霍乱弧菌 (GenBank登录号: KF446244)，其16 S rDNA序列与GenBank数据库中弧菌菌株的16 S rDNA序列有99%~100%的同源性，而且与霍乱弧菌菌株RD1(GenBank登录号:KF307775)的亲缘性最近。菌株BB31对四环素、庆大霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等抗生素的敏感性高，对磺胺甲氧嘧啶、呋喃唑酮、复方新诺明等抗生素不敏感。本研究证实霍乱弧菌是南美白对虾白便综合征的病原菌，庆大霉素、诺氟沙星等常规渔药可作为防控霍乱弧菌引起的南美白对虾白便综合征的用药参考。

关键词:霍乱弧菌；鉴定；药敏特性；白便综合征；南美白对虾

南美白对虾是深受消费者青睐的名特优水产品之一，具有生长速度快、养殖周期短、养殖产量高、经济收益好等特点，在我国已有近30年的养殖史，是我国水产品出口和内销的重要品种之一。目前，我国已在福建、海南、广西、山东以及珠三角、长三角、京津唐等地区进行了南美白对虾的大规模养殖，取得了显著的经济效益[1]。然而，自2011年以来，一种以“肝胰腺肿大，严重者糜烂；空肠或断肠；粪便呈白色棉线状、有黏性、浮在水面”为典型病症的白便综合征(俗称“白便病”)在南美白对虾养殖区频发，其危害性逐年增强。该病发病率高，传染性强，严重困扰着南美白对虾养殖户，也对整个南美白对虾产业链造成了严重的不利影响。从现有文献资料来看，我国对南美白对虾白便综合征的研究较少，鲜见有关该病病原菌及其控制药物等方面的详细报道，这阻遏了我国对南美白对虾白便综合征的控制进程。2014年7月，浙江省萧山区一养殖户淡水养殖的南美白对虾出现了严重的白便综合征，死亡率达到了60%~80%。本研究从自然发病的南美白对虾肝胰腺中分离鉴定了一株病原性霍乱弧菌，并进一步确定了该菌株的生理生化特性与药敏特性，以期为南美白对虾白便综合征的病原学研究与防控提供基础资料。

1材料与方法

1.1材料

具有典型病症的濒死南美白对虾，6尾，平均体重为8.23 g，取自浙江萧山一自然发病养虾池；健康南美白对虾，300尾，平均体重为10.12 g，购自上海崇明养殖场。

1.2 方法

1.2.1病原菌的分离将患病南美白对虾在无菌室用750 mL/L酒精反复擦拭消毒后，用无菌镊子挑取其肝胰腺至灭菌的白磁盘中，然后用无菌接种环蘸取肝胰腺分别在TCBS琼脂平板和普通营养琼脂平板上划线分离，将平板放置在30 ℃恒温培养18 h~24 h后进行菌株纯化，并将纯化后的菌株转接到普通营养琼脂斜面培养基上在30 ℃恒温培养24 h后4 ℃冰箱保存，次日备用。

1.2.2人工回归感染试验选取活力好、无病伤、体质健壮、大小均匀的健康南美白对虾进行人工回归感染试验。首先用无菌生理盐水分别将普通营养琼脂斜面培养基上的菌株菌苔洗下至无菌刻度管中，用稀释涂布平板法测定并将各分离菌株的菌悬液菌浓度调节为2.0×108CFU/mL，并将各菌株的菌悬液均匀喷洒在南美白对虾配合饵料上制成各分离菌株的菌饵，使各菌饵的菌浓度为1.0×108CFU/g，每日按虾总体重的2%投喂；对照组以不含分离菌株的相同南美白对虾配合饵料进行投喂[2]，每日投喂量为虾总体重的2%。连续投喂18 d，每3 d记录南美白对虾的发病情况与死亡数量，并将死虾捞出，同时取试验中发病刚死的南美白对虾肝胰腺，常规无菌操作进行病原菌再分离鉴定。每组南美白对虾各30尾，连续曝气，不换水，水温控制在为28 ℃。

1.2.3病原菌的鉴定

1.2.3.1生理生化鉴定参照曹海鹏等[3]的方法，用API 20E革兰阴性菌鉴定系统对分离的病原菌株进行生理生化鉴定。

1.2.3.2分子鉴定以分离的病原菌株的基因组DNA为模板，分别以27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)作为正向引物和反向引物，在94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min的条件下对病原菌株的16 S rDNA基因进行PCR扩增。PCR扩增产物的纯化与测序委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成。将病原菌株的16 S rDNA基因序列用DNA Man软件编辑后，在美国国立生物技术信息中心(NCBI)中利用BLASTN软件与GenBank数据库中已知细菌的16 S rDNA基因序列进行同源性比较，利用软件BioEdit 7.0和MEGA 4.0对同源性较高的相关细菌的16 S rDNA基因序列进行多重比较后，采用邻接法构建系统发育树。

1.2.4病原菌药敏特性的测定参照纸片扩散法[4]对分离的病原菌株进行药敏性分析，并根据《抗菌药物敏感性试验执行标准:第19版信息增刊》判定病原菌株对抗生素的敏感程度。其中，试验选用的各抗生素药敏纸片购于杭州天和微生物试剂有限公司。

2结果

2.1病原菌的分离

从患病南美白对虾的肝胰腺中共分离纯化出5株优势菌，分别暂命名为BB11、BB21、BB31、BB41和BB51。根据5株分离菌的人工回归感染试验结果(表1)，证实菌株BB31是南美白对虾白便综合征的病原菌。菌株BB31通过人工口服感染的方式对南美白对虾的致死率为73.33%，其感染的试验南美白对虾也表现出与自然病症基本相同的症状，而且从试验病死的南美白对虾肝胰腺中也分离到了与菌株BB31形态特征、理化性质一致的菌株。

2.2病原菌的鉴定

API 20E革兰阴性菌鉴定系统对菌株BB31的鉴定结果(表2)表明，菌株BB31为霍乱弧菌(Vibriocholerae)，鉴定结果的可信度为99.9%。此外，通过对菌株BB31大小为1 500 bp的16 S rDNA基因序列(GenBank登录号：KF446244)进行测序和同源性比较，结果表明菌株BB31的16 S rDNA基因序列与GenBank数据库中弧菌属菌株的16 S rDNA基因序列的同源性高达99%~100%。基于菌株BB31 16 S rDNA基因序列构建的系统发育树(图1)进一步表明，菌株BB31与霍乱弧菌菌株RD1(GenBank登录号：KF307775)的亲缘性最近。结合API 20E革兰阴性菌鉴定系统鉴定与16 S rDNA基因序列分析的结果，判定菌株BB31为霍乱弧菌。

表1　分离菌株对南美白对虾人工回归感染试验结果

表2　API 20E革兰阴性菌鉴定系统测定的菌株BB31的生理生化特征

注：+. 阳性；-. 阴性。

Note: +. positive; -. negative.

括号中的序号代表菌株的GenBank登录号; 分支点上的数字代表计算1 000次聚类到一起的几率; 标尺刻度代表0.05%的序列差异。

The number in the bracket means GenBank accession number of the strain; the number at the node means the percentage of occurrence in 1 000 boot-strapped trees; the scale bar means 0.05% sequence difference.

图1通过邻接法构建的基于菌株BB31及相关菌株 16 S rDNA基因序列的系统发育树

Fig.1Phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method, based on 16 S rDNA gene sequences of strain BB31 and other related strains

2.3病原菌的药敏特性

菌株BB31对15种抗生素的敏感试验结果(表3)表明，菌株BB31对四环素、庆大霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星等5种抗生素敏感性较高，对新霉素、链霉素的敏感性次之，对氨苄西林、磺胺甲氧嘧啶、呋喃唑酮、头孢三嗪、头孢呋新、头孢他啶、头孢噻肟、复方新诺明等8种抗生素耐药。

表3 菌株BB31的药敏特性

注：S. 高度敏感；I.中度敏感；R.耐药。

Note: S. Sensitivity; I. Intermediate sensitivity; R. Resistance.

3讨论

霍乱弧菌是一种对我国水产养殖具有巨大危害性的病原菌。据报道[5-8]，霍乱弧菌迄今已经导致泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)、鲫(Carassiusauratus)、草鱼(Ctenopharyngodonidllus)、暗纹东方鲀(Fuguobscurus)等水产养殖品种发病死亡，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。然而，从现有文献资料来看，关于南美白对虾白便综合征病原菌的详细研究较少，更未见到霍乱弧菌引起南美白对虾白便综合征的相关报道。本研究证实霍乱弧菌是南美白对虾白便综合征的病原菌，并分析了其生理生化特征、药敏特征等相关特性，再一次表明了我国水产养殖要加强对霍乱弧菌的防控力度，同时也推进了南美白对虾白便综合征的病原学研究进程。

白便综合征已经成为近年来南美白对虾养殖生产中仅次于早期死亡综合征的重大疾病，养殖户谈“白便”色变。至于该病的病因，张水波[9]分析认为细菌是南美白对虾白便综合征的病原，并同时认为水质恶化、摄食变质饲料造成消化机能受损可能与该病的发生有关；彭小云[10]认为一种类似弧菌的病原可能导致该病的发生，并进一步指出天气突变、倒藻、底质变坏、饵料霉变、蓝藻暴发、消化机能受损等因素能够诱发该病发生或导致该病病情加重。本研究表明霍乱弧菌是南美白对虾白便综合征的病原菌，并能够导致南美白对虾出现大量死亡。至于霍乱弧菌引起南美白对虾白便综合征的发病机理，可能是由于霍乱弧菌在南美白对虾肠组织中经大量生长增殖、黏附肠黏膜表面、产生毒力因子，引起肠壁黏膜损伤，进一步通过血淋巴循环至肝胰腺组织并在其中繁殖和产生毒素后，导致肝胰腺出现肿大、糜烂等病变，最终促使肝胰腺和肠对相关消化液或消化酶合成和分泌功能失常，导致南美白对虾发病死亡。当然，除了霍乱弧菌本身因素外，调查发现该病的发生与养殖水质和底质恶化、养殖户投喂变质饲料或不正常投饲也有较大的关系。

不同来源的霍乱弧菌的药敏特性往往具有菌株差异性。秦蕾等[6]从患病异育银鲫体内分离的霍乱弧菌菌株对先锋霉素V、头孢他啶等头孢类抗生素高度敏感；陈冬娥等[11]从鳄鱼体内分离的霍乱弧菌菌株对头孢噻肟、头孢呋新等头孢类抗生素高度敏感。本试验对霍乱弧菌菌株BB31的药敏特性也进行了分析，发现菌株BB31对包括头孢噻肟、头孢呋新、头孢他啶等在内的头孢类抗生素耐药，这与秦蕾等[6]和陈冬娥等[11]分离的霍乱弧菌菌株的药敏特性不同。此外，菌株BB31对庆大霉素、恩诺沙星、诺氟沙星等抗生素的敏感性高，说明菌株BB31对这些常规渔用抗生素并未产生严重的抗药性，为该病防控过程中的合理用药提供了理论参考。

养殖水环境中和南美白对虾体内残留的渔用抗生素对南美白对虾健康养殖产生的严重不良影响已经毋庸置疑。这些渔用抗生素残留对霍乱弧菌耐药性的诱导产生、耐药基因水平扩散和垂直传播具有重要的作用，容易造成养殖水环境中和南美白对虾体内的霍乱弧菌对抗生素耐药性的增强、南美白对虾抗病能力降低和抗生素残留量增大，进而对南美白对虾养殖产量和质量产生了潜在威胁。因此，在南美白对虾养殖过程中，监测霍乱弧菌对常规渔用药物的敏感程度、避免临床盲目用药显得尤为重要[12]。值得一提的是，目前对霍乱弧菌起效的抗微生物药物种类正在减少，因而除了对霍乱弧菌进行药物控制外，开展霍乱弧菌的生物防治将是今后主要的发展方向。目前，我国已经针对霍乱弧菌的生物防治进行了蛭弧菌、噬菌弧菌等蛭弧菌类生物和噬菌体的研究，为其生物控制技术的建立奠定了良好的基础[13-15]。

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动物医学进展,2016,37(2):133-136ProgressinVeterinaryMedicine

Isolation and Antimicrobial Sensitivity Test of AVibriocholeraeStrain fromPenaeusvannameiwith White Fecal Syndrome

CAO Hai-peng1，2，3， WEN Le-fu1，2，3， ZHOU Gui-xian1，2，3， ZHANG Fan1，3， HE Shan1，2，3

(1.KeyLaboratoryofFreshwaterFisheryGermplasmResources,MinistryofAgricultureofChina,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai, 201306,China; 2.ShanghaiEngineeringResearchCenterofAquaculture,Shanghai, 201306,China;3.ShanghaiUniversityKnowledgeServicePlatform,ShanghaiOceanUniversityAquaticAnimalBreedingCenter(ZF1206),Shanghai, 201306,China)

Abstract:In order to confirm the bacterial pathogen of Penaeus vannamei white fecal syndrome and its antimicrobial sensitivity, a pathogenic strain BB31 was isolated from white fecal syndrome Penaeus vannamei using traditional methods, identified by API 20E Gram negative bacterial identification system, 16 S rDNA sequence and phylogenetic analysis. Its antimicrobial susceptibility was also analyzed by Kirby-Bauer test. The results showed that strain BB31 was a Vibrio cholerae strain with its GenBank accession No. KF446244, its 16 S rDNA sequence had a 99%-100% homology with those of Vibrio strains, and showed a closest relationship to that of V. cholerae strain RD1 with GenBank accession No. KF307775. Strain BB31 exhibited a high sensitivity to tetracycline, gentamycin, enrofloxacin, ofloxacin and norfloxacin, showed a resistance against sulfametoxydiazine, compound sulfamethoxazole, furazolidone. This study confirmed Vibrio cholerae as a pathogen of white fecal syndrome Penaeus vannamei, and common fishery antimicrobial such as gentamycin and norfloxacin may be regarded as useful antimicrobial in the control of Penaeus vannamei white fecal syndrome caused by Vibrio cholerae.

Key words:Vibrio cholerae; identification; antimicrobial susceptibility; White fecal syndrome; Penaeus vannamei

文章编号:1007-5038(2016)02-0128-05

中图分类号:S945.46

文献标识码:B

作者简介：曹海鹏(1981-)，男，山东招远人,讲师，博士，主要从事水产动物病害防治与微生态制剂的开发研究。*通讯作者

基金项目：上海海洋大学科技发展专项基金；江苏省科技支撑计划项目(No. BE2013366); 闵行区中小企业技术创新计划项目; 上海海洋大学水产类人才创新创业实训基地(泗洪)项目；闵行区产学研合作计划项目

收稿日期：2015-04-27