乳头药浴涂膜剂对奶牛乳房炎致病菌体外抑菌效果评价

冯万宇，徐　馨，张　艳，黄　健

(黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔 161006)



乳头药浴涂膜剂对奶牛乳房炎致病菌体外抑菌效果评价

冯万宇，徐馨，张艳，黄健

(黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔 161006)

摘要:为探讨以聚维酮碘为主要成分的奶牛乳头药浴涂膜剂对奶牛乳房炎致病菌的体外抑菌效果，为临床试验提供科学依据,以纯水浸泡、加热制成PVA胶浆液为成膜基质，将经纯水预处理的PVP-I加入其中，随后加入一定比例甘油作为增塑剂，充分融合后制成奶牛乳头药浴涂膜剂；采用10倍稀释法进行乳头药浴涂膜剂对奶牛乳房炎临床分离的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌及停乳链球菌4种主要致病菌的最小抑菌杀菌浓度试验，试验同时设青霉素和头孢噻呋的抗生素对照。结果表明，乳头药浴涂膜剂4种致病菌有良好的体外抑菌和杀菌作用，其抑杀菌浓度低于头孢噻呋和青霉素。乳头药浴涂膜剂对奶牛乳房炎致病菌有较好的抑菌效果，可以用其作为奶牛乳头药浴药物替代临床常用抗生素预防。

关键词:奶牛乳房炎；致病菌；乳头药浴涂膜剂；体外抑菌杀菌试验

奶牛乳房炎是降低奶牛泌乳量、损害乳质，危害奶牛养殖、制约奶牛养殖业发展的重要因素之一，它不仅会影响奶牛泌乳量，诱发其他疾病，造成消费性饲养，而且重度乳房炎还会造成奶牛丧失泌乳能力，从而使部分奶牛的被迫淘汰。除了疾病引起的经济损失，也给人类健康及公共卫生造成巨大危害[1-2]。

病原微生物是引起奶牛乳房炎的主要原因，迄今为止相关病原报道已达150多种以上，病原菌通过乳头管口侵入是引起乳房炎的主要因素。随着季节、品种、区域等不同情况分离到的致病菌种类差异也很大，主要分离到的包括大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房炎链球菌等[3-4]。诸多的专家学者为研究和探索防治乳房炎做了大量卓有成效的工作，研制出许多治疗药物和防治措施，但主要还是全身及乳房局部的抗感染治疗[4-6]。全身用药不但大量消耗药物导致费用较高，而且在乳房局部难以达到和维持彻底杀菌的有效药物浓度，而且极易引起牛体及乳制品药物残留和超标[7]。干奶期乳头管注射长效抗生素和泌乳期挤奶前后乳房消毒是目前比较被广大奶牛场采纳和接受的最普遍的方法，由于抗生素7的大量临床应用产生的细菌耐药性，使治疗效果不尽人意，抗生素残留造成的废弃奶也是抗生素治疗的不利结果[8-9]。利用洗必泰、高锰酸钾、新洁尔灭、碘及聚维酮碘进行奶牛乳头药浴是目前预防奶牛乳房炎比较常用的方法。

聚维酮碘为近些年临床比较常用的消毒防腐剂，具有抗菌谱广、不易产生耐药性的优点，对临床常见细菌均有杀灭作用，病毒、真菌、衣原体、结核杆菌等也对其十分敏感，临床上已有多种剂型的聚维酮碘产品用于皮肤黏膜的杀菌消毒，效果明显，以聚维酮碘为主要作用成分的乳头药浴涂膜剂用于治疗和预防奶牛乳房炎尚未见报道。

本试验考察以聚维酮碘为主药的乳头药浴涂膜剂对奶牛乳房炎4种致病菌的体外抑菌效果，测定其最小抑菌浓度和杀菌浓度，为其临床用药提供技术依据，这对于防治奶牛乳房炎兽药新剂型研究及提高治疗疗效，提升奶牛保健水平，推动奶牛养殖健康发展具有重要意义[10-11]。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验菌株大肠埃希菌20100528、金黄色葡萄球菌20091031、无乳链球菌20110708及停乳链球菌20070331四种菌株由黑龙江省兽医科学研究所牛病研究室自齐齐哈尔及其周边市县采集经生化鉴定后予以编号。

1.1.2试验药品5%聚维酮碘，购自齐齐哈尔医药商厦；盐酸头孢噻呋及青霉素购自中国兽药监察所，乳头药浴涂膜剂由黑龙江省兽医科学研究所提供，批号：201104。

1.1.3主要仪器及培养基泰勒斯超净台；泰斯特DH-4000恒温培养箱；YX280A手提式高压蒸汽灭菌器；ZW-A微量振荡器、肉汤及普通琼脂培养基为杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.2方法

1.2.1细菌培养将冰柜冻存的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、无乳链球菌等4种菌种取出，分别接种至相应培养基中，置于恒温箱37 ℃培养24 h~48 h。取出培养物，选取典型菌落转种3代备用。

1.2.2药液制备将头孢噻呋、青霉素标准品用相应磷酸盐缓冲液稀释成浓度为100 mg/mL，乳头药浴涂膜剂(黑龙江省兽医科学研究所牛病研究室自制，有效碘含量为1.5 g/L)，生理盐水稀释为0.80 mg/mL溶液，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 奶牛乳房炎病原菌CFU测定

1.2.3.1病原菌扩增用接种环挑取每一复苏菌种单个菌落接种到10 mL灭菌肉汤培养基中37 ℃恒温培养18 h备用。

1.2.3.2病原菌CFU测定取经121 ℃ 30 min处理的EP管9只，每个管中加入普通肉汤 900 μL，在第一个EP管中加入100 μL 1.2.3.1中扩增的菌液，混合均匀后取100 μL加到第2管中，如此依次10倍稀释至第9管。取105~109等5个稀释度菌液各100 μL以混碟法方式分别接种至营养琼脂平板中，倒置于37 ℃培养箱培养18 h~24 h后计数，选取菌落数在30个~300个的稀释度计算CFU。

1.2.4奶牛乳房炎致病菌药物敏感性测定将纯化的细菌接种肉汤，37 ℃培养箱中培养18 h后依据测定的CFU将菌液稀释至106CFU/mL。在96孔微量平板1孔~12孔各加无菌肉汤100 μL，向第1孔中加100 μL药物原液(256 μL/mL)，2倍稀释至第10孔，第10孔稀释好后吸100 μL弃之，11孔为不加菌液、12孔为不加药物对照。除11孔外，其他各孔分别加入106CFU/mL菌液10 μL，微量振荡器2 min后37 ℃恒温培养24 h~48 h。每种药物做4个重复，培养24 h记录最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，培养48 h记录最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)。

2结果

2.1奶牛乳房炎致病菌培养基计数结果

奶牛乳房炎致病菌培养基计数结果见表1，每毫升样品细菌数见表2。

表1　奶牛乳房炎致病菌培养基计数

表2　奶牛乳房炎4种致病菌每毫升样品中细菌数量

由表1、表2中可以看出，4种临床分离株在肉汤培养基中进行体外培养时生长速度比较相近，其中大肠埃希菌CFU为3.21×107/mL、金黄色葡萄球菌CFU为3.49×107/mL、无乳链球菌为CFU为3.38×107/mL、停乳链球菌CFU为3.07×107/mL，差异不显著(P>0.05)。

2.2乳头药浴涂膜剂与抗生素对奶牛乳房炎病原菌体外抑菌效果比较

头孢噻呋、青霉素和乳头药浴涂膜剂对奶牛乳房炎4种病原菌大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌的体外抑菌试验结果见表3。

由表3可以看出，乳头药浴涂膜剂对临床分离的4种奶牛乳房炎致病菌最小抑菌浓度(MIC)比头孢噻呋、青霉素低8倍~250倍，最小杀菌浓度(MBC)比头孢噻呋、青霉素低16倍~250倍以上。由此可见，分离到的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌对青霉素产生耐药，虽然无乳链球菌和停乳链球菌尚未对青霉素产生耐药性，但其抑菌和杀菌浓度也比以前报道的大有增加，提示在应用青霉素治疗奶牛无乳链球菌、停乳链球菌乳房炎时，应当根据药敏试验结果选用高敏药物和适当剂量，不能完全依照临床兽医人员经验性的推荐剂量或所谓最高剂量，从而减少耐药菌株产生和治疗失败。头孢噻呋对临床分离的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌菌株的最小抑菌浓度(MIC)最高值为5.20、最小杀菌浓度最高值为10.50，其抑杀菌效果也比较理想，可用于奶牛乳房炎的治疗，但其抑杀菌效果低于乳头药浴涂膜剂。以上结果表明乳头药浴涂膜剂对奶牛乳房炎病原菌大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌菌株杀菌作用强，且不会导致菌株产生耐药性。

表3　乳头药浴涂膜剂、头孢噻呋及青霉素对奶牛乳房炎主要致病菌的抑菌效果比较

3讨论

3.1挤奶前后利用乳头药浴涂膜剂药浴防治奶牛乳房炎的优点

聚维酮碘目前人类医学和动物医学临床较为常用的一种消毒杀菌剂，具有广谱抗菌、强力杀菌、无耐药性和毒性低等特点，对细菌、真菌、原虫和病毒均有很好的杀灭作用。其机理是通过与病原微生物细胞接触，缓慢释放出的碘分子，破坏细胞膜及蛋白质而起杀灭作用。除用于用于皮肤黏膜消毒以外，在临床上也用于防治多种疾病[5]。乳头药浴涂膜剂是以聚维酮碘为主要成分的一种新型可用于奶牛挤奶前后乳头药浴的高效广谱杀菌剂，它通过逐步释放出原子碘卤化菌体蛋白质，使其变性而导致病菌死亡。由于使用方便，性状稳定，其对奶牛乳房皮肤无刺激和损伤，不产生二次污染，适用于挤奶间歇期奶牛乳头药浴。

本试验研究结果表明，对奶牛乳房炎4种致病菌的体外抑菌效果为乳头药浴涂膜剂>头孢噻呋>青霉素，可见其对奶牛乳房炎致病菌抑杀效果高于敏感抗生素十分理想，不易引发细菌耐药性，不产生抗生素奶导致的额外休乳期和休药期。根据资料报道，涂膜剂既能够避免药物通过肠胃的首过效应，也能够减轻药物毒副作用和不良反应。根据不同药物要求，利用不同性质和规格的成膜材料可以制备出不同特性的涂膜剂[6]。应用涂膜剂可以减少皮肤表面水分蒸发，使皮肤角质层水化，增加皮肤渗透性，从而有利于促进药物透过角质吸收发挥更好的治疗作用。同时，涂膜剂也隔断了外部细菌在皮肤表面滋生的机会。以聚维酮碘为主药的乳头药浴涂膜剂制法简单，使用后奶牛无不适感。

3.2抗生素防治奶牛乳房炎的优劣

利用抗生素防治奶牛乳房炎是几十年以来国内外普遍采用的方法，在奶牛乳房控制工作中有不可替代的作用[12-13]，可以说，没有抗生素的大量临床应用，就没有各国畜牧业蓬勃发展的今天。近些年，尤其是进入新世纪以来，对乳及乳制品安全性要求越来越高，无抗、绿色、安全已渐入人心，运用抗生素治疗奶牛乳房炎有诸多缺点：①抗生素长期使用使病原微生物的抗药性增加，耐药菌株使抗生素失去作用；②乳中残留抗生素产生废弃奶处理不当，能污染环境和危害人及动物身体健康[14-15]；③大量、不当和长期应用抗生素治疗乳房炎还可能导致畸形后代，使优良基因无法遗传到下一代；④抗生素不当使用会影响奶牛胃肠道消长，破坏了奶牛体内微生态平衡，通过增大使用剂量或是更换抗生素品种的做法也容易造成药品的浪费，增加饲养管理成本；⑤乳房炎治疗过程中有一定数量的抗生素通过血液进入乳汁，导致乳汁抗生素的残留超标，药物残留超标奶被废弃，造成巨大的经济损失[16]。

本研究考察了以聚维酮碘凝胶为主药的乳头药浴涂膜剂对奶牛乳房炎4种主要致病菌的体外抑菌效果，测定了其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，冀望对奶牛乳房炎防治及用药提供技术依据。试验结果表明，乳头药浴涂膜剂对奶牛乳房炎4种致病菌体外抑菌效果好，其MIC和MBC均低与头孢噻呋，更远远低于青霉素，乳头药浴涂膜剂对子宫内膜炎致病菌的体外抑菌效果明显优于头孢噻呋和青霉素。此外，乳头药浴涂膜剂不易引发细菌耐药性，与预期结果相符合。进一步研究挤奶间期奶牛乳头药浴后对乳头表面及乳头管口乃至管内微生物灭杀菌效果，是本研究的下一步所要解决的主要问题之一。

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Evaluation of Bacteriostatic Effects of Teat Dipping Coating Agent on Pathogenic Bacteria Causing Cow MastitisinVitro

FENG Wan-yu，XU Xin，ZHANG Yan，HUANG Jian

(HeilongjiangAcademyofVeterinaryMedicine，Qiqihar,Heilongjiang，161006,China)

Abstract:In order to understand the bacteriostatic effects of the teat dipping coating agent on major pathogens causing cow mastitis and provide science evidence for clinical trial, the mucilage of PVA which was dipped and heated then affiliated the PVP-I which was primed in purified water and added in a certain ratio glycerol as plasticizer, after all of them, fully integrated into the teat dipping coating agent. Utilizing 10 times microdilution method，we determine in vitro effectiveness of the teat dipping coating agent on clinical isolates. In order to compare bacteriostatic effectiveness of the teat dipping coating agent and antibiotics，ceftiofur and penicillin were used as controls. The results showed that in vitro the agent had significant bacteriostatic effects on four major pathogens of cow mastitis, and the bactericidal and bacteriostatic concentrations were lower than that of ceftiofur and penicillin.

Key words:dairy cow mastitis; pathogen; teat dipping coating agent; bactericidal and bacteriostatic test in vitro

文章编号:1007-5038(2016)02-0133-04

中图分类号:S857.26

文献标识码:B

作者简介：冯万宇(1976-),男,黑龙江木兰人，副研究员,硕士,主要从事奶牛普通病防治新技术的研究。

收稿日期：2015-05-25