宠物源大肠埃希菌的分离鉴定和耐药性研究

刘　果，纪　雪，孙　洋，刘　哲，祝令伟，刘　军，周　伟，郭学军，冯书章

(军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122)



宠物源大肠埃希菌的分离鉴定和耐药性研究

刘果，纪雪*，孙洋，刘哲，祝令伟，刘军，周伟，郭学军，冯书章*

(军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122)

摘要:为调查长春地区宠物源大肠埃希菌耐药流行情况，从2家宠物医院采集135份宠物肛拭子样品，分离和鉴定大肠埃希菌并进行多重PCR分群。测定大肠埃希菌分离株对19种抗菌药物的耐药性，并鉴定超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)表型。共分离鉴定获得95株宠物源大肠埃希菌，它们对氨苄西林和哌拉西林的耐药率最高(78.9%和76.8%)；其次是四环素(61.6%)；对头孢唑林、头孢噻肟、头孢吡肟、庆大霉素、复方新诺明、环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率均超过了50%；所有分离株均对亚胺培南和美罗培南敏感。其中15个分离株对受试的抗菌药物全部敏感(15.8%)，63株呈多重耐药表型(66.3%)。ESBLs型菌株占53.7%。本研究探明了长春地区宠物源大肠埃希菌的耐药流行情况，对宠物临床上用药具有指导价值。

关键词:大肠埃希菌；耐药性；超广谱β内酰胺酶；宠物

随着我国宠物行业的快速发展，越来越多的抗生素被用于宠物疾病的预防和治疗。在抗生素的选择压力下，细菌耐药性也越来越严重，耐药性的产生和加剧必然为细菌性疾病的治疗带来困难。由于宠物寿命长，与主人接触多，促进了微生物群落在二者之间的相互转移，通过皮肤接触或由携带微生物的唾液、粪便直接传播，或通过家庭环境间接传播[1]。因此，宠物的抗生素耐药性不仅是兽医上的一个重要问题，同时也对公共卫生产生威胁[2]。大肠埃希菌作为机体肠道内较为常见的细菌之一，成为各种耐药基因的储存库。因此，研究宠物源大肠埃希菌的耐药性具有重要意义。本研究调查了2015年长春地区宠物源大肠埃希菌的耐药流行情况，为宠物的临床用药提供了科学依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品采集2015年4月，从吉林省长春市2家宠物医院共采集135份肛拭子样品(其中犬122份、猫13份)。

1.1.2主要仪器生物安全柜(1300A2)为美国Thermo公司产品；BD PhoenixTM-100 System细菌鉴定仪、PhoenixSpecTM 比浊仪均为美国BD公司产品。

1.1.3主要试剂与培养基麦康凯琼脂为青岛高科园海博生物技术有限公司产品；胰蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸粉、可溶性淀粉为英国Oxoid公司产品；大肠埃希菌显色培养基为法国科玛嘉公司产品。

1.2方法

1.2.1大肠埃希菌分离纯化向肛拭子样品管中加入1 mL 8.5 g/L的无菌生理盐水， 37 ℃恒温180 r/min震荡10 min，静置2 min。无菌条件下，用接种环蘸取上清液于麦康凯琼脂培养基平板上划线，37 ℃过夜培养。每块平板上随机挑取一个紫红色、边缘光滑的单菌落于显色培养基上划线，37 ℃过夜培养。挑取紫红色单菌落接种于1 mL LB液体培养基中，37 ℃恒温180 r/min振荡培养过夜。

1.2.2大肠埃希菌PCR鉴定根据文献[3]，用大肠埃希菌16 S rDNA特异性引物对大肠埃希菌分离株进行PCR鉴定，引物序列见表1。

1.2.3大肠埃希菌生化鉴定和药敏检测通过BD PhoenixTM-100 System全自动微生物鉴定/药敏系统对PCR鉴定阳性的大肠埃希菌分离株进行生化鉴定、药敏检测以及超广谱β内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)表型判定。

1.2.4大肠埃希菌分群鉴定根据文献[4]，利用多重PCR方法分群，可将大肠埃希菌分为A群、B1群、B2群、D群和未知群5个类别。分群鉴定引物序列如表2。

表1　大肠埃希菌特异性16 S rDNA鉴定引物

表2　大肠埃希菌分群鉴定引物

2结果

2.1大肠埃希菌分离鉴定

通过麦康凯选择性培养基和科玛嘉显色培养基，以及大肠埃希菌特异性16 S rDNA PCR鉴定和细菌鉴定仪检测，从135份肛拭子样品中分离得到95株大肠埃希菌分离株。

2.2大肠埃希菌药敏检测

对95株宠物源大肠埃希菌进行6类(19种)抗生素的药物敏感性检测，并判定ESBLs表型。抗生素耐药率如图1。结果表明，宠物源大肠埃希菌分离株对氨苄西林(AMP)和哌拉西林(PIP)的耐药率最高，分别为78.9%(75/95)和76.8%(73/95)；其次是四环素(TET)，耐药率高达61.6%(58/95)；对头孢唑林(CZO，56%，53/95)、头孢噻肟(CTX，52.6%，50/95)、头孢吡肟(FEP，50.5%，48/95)、庆大霉素(GEN，56%，53/95)、复方新诺明(SXT，50.5%，48/95)、环丙沙星(CIP，51.6%，49/95)和左氧氟沙星(LVX，50.5%，48/95)耐药严重，耐药率均超过了50% ；对氯霉素(CHL，37.9%，36/95)和氨苄西林-舒巴坦(SAM，30.5%，29/95)中度耐药；对阿米卡星(AMK，17.9%，17/95)、头孢他啶(CAZ，12.6%，12/95)、氨曲南(ATM，23.2%，22/95)、阿莫西林-克拉维酸(AMC，2.1%，2/95)相对敏感；仅对亚胺培南(IMP)和美罗培南(MEM)全部敏感。经细菌鉴定仪判定为ESBL表型的大肠埃希菌占53.7%(51/95)。

图1　宠物源大肠埃希菌对抗生素耐药率

2.3耐药谱分析

对宠物源大肠埃希菌分离株耐受的抗生素种类及其对应的耐药菌株数、百分比和主要的耐药模式进行统计和分析，结果见表3。仅有15株大肠埃希菌分离株对所有抗生素全部敏感(15.8%，15/95)，有9株大肠埃希菌对1种~3种抗生素耐药(9.47%，9/95)，其余全部表现出对3种及以上的抗生素耐药。对4种~6种抗生素耐药的有18株(18.9%，18/95)；对7种~9种抗生素耐药的有17株(17.9%，17/95)；对10种~12种抗生素耐药的有29株(30.5%，29/95)；对13种~15种抗生素耐药的有7株(7.37%，7/95)。其中，对12种抗生素耐药的菌株高达15株(15.8%，15/95)。频率最高的耐药模式为AMP-ATM-CAZ-CIP-LVX-CHL-TET -CZO-CTX-FEP-GEN-PIP(6.31%，6/95)。

表3　宠物源大肠埃希菌主要耐药模式

进行耐药性检测的抗生素有六大类，包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类、喹诺酮类、氯霉素类和四环素类。一般定义对三类及三类以上抗生素耐药的细菌为多重耐药菌(Multidrug resistance MDR)。如图2所示，多重耐药菌为63株(66.3%，63/95)，其中对五类抗生素耐药的菌株最多，为27株(28.4%，27/95)，对所检测的六类抗生素全部耐药的有11株(11.6%，11/95)。

图2　宠物源大肠埃希菌多重耐药模式

2.4大肠埃希菌分群

大肠埃希菌分群结果如图3和表4所示。B2和D群大肠埃希菌数量相当，且显著高于A和B1群，未知群的数量最少。B2和D群大肠埃希菌被认为是常见的致病性大肠埃希菌，在本研究中，B2和D群大肠埃希菌占53.7%(51/95)。

2.5大肠埃希菌分群与多重耐药的关系

由于B2和D群被认为是常见的致病性大肠埃希菌，将5个群分为A+B1+未知群和B2+D 2组；将三类及以上抗生素耐药(≥3R)的菌株定义为多重耐药菌。进而分析非多重耐药菌和多重耐药菌在致病菌和非致病菌两组中的分布，来探究耐药性与致病性之间的关系，结果见表5。本研究中，非多重耐药菌在B2和D组中的分布显著高于A+B1+未知群组的分布，多重耐药菌在A+B1+未知群组中的分布显著高于B2和D组中的分布。

1.未知群；2.A群； 3.B1群； 4~5.D群； 6~7.B2群；M. DNA标准DL 2 000

1.Group untyped; 2.Group A; 3.Group B1; 4-5.Group D; 6-7. Group B2; M. DNA Marker DL 2 000

图3　大肠埃希菌的多重PCR分群结果(部分)

表5　多重耐药菌株在不同分群中的分布

3讨论

近年来，随着抗生素的滥用，从宠物中分离到越来越多的多重耐药大肠埃希菌，其中包括一些与人源分离株极其相似的菌株，如ST131和ST648菌株[5-6]。充分的证据表明细菌及其携带的耐药性能够在人和动物之间水平传播[7]。因此，宠物源大肠埃希菌耐药菌株的出现，不仅限制了宠物临床治疗的抗生素药物的选择，还威胁到人类健康，给公共卫生带来严重影响。

研究显示，宠物源大肠埃希菌对早期抗生素如氨苄西林和四环素耐药情况都相当严重，对目前临床上的常用抗生素-头孢噻肟、庆大霉素、磺胺类、喹诺酮类抗生素的耐药率也都超过了50%，这表明在抗生素的选择压力下宠物源大肠埃希菌已经严重耐药。而对于同一类型的抗生素，庆大霉素(56%)和阿米卡星(17.9%)的耐药率差异较大，第三代头孢菌素中，头孢噻肟(52.6%)和头孢他啶(12.6%)的耐药率差异较大，这可能与临床上药物的使用频率相关。

本研究中宠物源大肠埃希菌分离株对各种抗生素的耐药率均远高于国外同类研究中的报道[8]。其中对氨苄西林(78.9%)、庆大霉素(56%)、氯霉素(37.9%)和环丙沙星(51.6%)的耐药率与蒋月[9]、贺志沛等[10]等报道的其他地区的宠物肛拭子样品中大肠埃希菌分离株的耐药率相近。而这些分离株对于阿米卡星(17.9%)、阿莫西林-克拉维酸(2.1%)和复方新诺明(50.5%)的耐药率明显偏低。可见，长春地区宠物源大肠埃希菌耐药性在整体上略低于国内其他地区。

在兽用抗生素方面，β-内酰胺类药物是治疗革兰氏阴性细菌感染的最重要、最广泛使用的抗菌药物[11]，其不合理的使用会加剧ESBLs菌株的流行。本研究中长春地区宠物源ESBL表型菌株比例(53.7%)虽然显著低于2013年赵相胜等[12]报道的比例(67.7%)，仍远远高于国外相关报道[13-14]，也显著高于Sun等[15]对广东省宠物源大肠埃希菌研究中的比例(40.4%)，可能与长春地区宠物临床治疗中频繁使用头孢菌素有关。

在大肠埃希菌分群方面，B2和D群大肠埃希菌比例(53.7%)明显高于2013年赵相胜等[12]获得的宠物源大肠埃希菌B2和D群比例(41.0%)。在耐药情况与分群关系的研究中，我们发现多重耐药菌多为非致病菌株，说明与致病菌株相比，非致病菌株耐药更严重，这一现象也值得深入研究。

动物抗生素耐药问题已经引起了越来越多的关注，各国抗生素使用和耐药菌监测系统都加强了对兽用抗生素及动物源耐药菌的监管。如法国的Resapath、德国的GERM-Vet和丹麦的DNAMAP，我国也建立了动物源细菌耐药性监控系统[16]。大量研究表明，我国动物源细菌抗生素耐药情况比国外更为严重，抗生素使用和细菌耐药性发生和传播存在直接的因果关系。新型抗生素的研发仍然任重而道远，这就要求人们更加重视合理地使用抗生素，显然这是兽医工作人员、政府监管机构、公共卫生部门及动物饲养者所面临的严峻挑战。

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动物医学进展,2016,36(2):125-128ProgressinVeterinaryMedicine

Isolation, Identification and Antimicrobial Resistance ofEscherichiacoliin Companion Animals

LIU Guo, JI Xue, SUN Yang, LIU Zhe, ZHU Ling-wei, LIU Jun,ZHOU Wei, GUO Xue-jun,FENG Shu-zhang

(InstituteofMilitaryVeterinaryMedicine,AMMS,KeyLaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl,Changchun,Jilin, 130122,China)

Abstract:The occurrence of antimicrobial-resistant Escherichia coli and related resistance characteristics were investigated in companion animals in Changchun. E. coli were isolated and identified from 135 anal swab samples from two pet hospitals. Triplex PCR was used to detect E. coli phylogenetic groups. The resistance to 19 antimicrobial agents and extended-spectrum β-lactamases(ESBLs) phenotype were detected by BD PhoenixTM-100 System. Among 95 isolates, 78.9% showed resistance to ampicillin, 76.8% showed resistance to piperacillin, followed by 61.6% showed resistance to tetracycline. More than 50% isolates showed resistance to cefazolin, cefotaxime, cefepime, gentamicin, trimethoprim-sulfamethoxazole, ciprofloxacin and levofloxacin. However, all these isolates were sensitive to imipenem and meropenem. Furthermore, 15 isolates were sensitive to all the antimicrobials tested (15.8%). 63 isolates presented multidrug resistance phenotype (66.3%). 53.7% of these isolates presented ESBL phenotype. This study provided the epidemiological characteristics of antimicrobial-resistant E. coli from pets in Changchun, which may be useful for companion animal treatment.

Key words:Escherichia coli; antimicrobial resistance; extended-spectrum β-lactamases; companion animal

文章编号:1007-5038(2016)02-0120-05

中图分类号:S852.612

文献标识码:B

作者简介：刘果(1989-),女，河南南阳人，硕士研究生，主要从事细菌耐药性研究。*通讯作者

基金项目：国家科技部传染病重大专项(2013ZX10004-217-002)；863项目(2012AA022006)；吉林省科技计划项目(20150101110JC)

收稿日期：2015-07-17