蛋白质互作研究技术

吴　健，朱海霞，赵志荀，颜新敏，赵银龙，吴　娜，李　健，张志东，张　强，李　影，吴国华*

(1.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部畜禽病毒学重点开放实验室，甘肃兰州 730046；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118；3.西北民族大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730124)



蛋白质互作研究技术

吴健1,2，朱海霞1，赵志荀1，颜新敏1，赵银龙3，吴娜1，李健1，张志东1，张强1，李影2*，吴国华1*

(1.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部畜禽病毒学重点开放实验室，甘肃兰州 730046；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118；3.西北民族大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730124)

摘要：蛋白质在生物体的机制中是必不可少的，担任着生物系统内启动以及执行的任务。生物体的每一个生物过程，从遗传物质复制到细胞衰老与死亡，依赖于几种甚至几百种蛋白质之间的功能协调。蛋白质的功能，结构的改变会破坏这种平衡，导致疾病的发生，通常这种情况是由于蛋白间的相互作用引起的。目前有很多蛋白质的结构功能是未知的，所以蛋白质组学发展的也尤为迅速。论文主要综述了双向电泳、噬菌体展示技术、GST pull-down、酵母双杂交、串联亲和纯化、双分子荧光互补技术、蛋白质芯片、Far Western blot、免疫共沉淀9个蛋白质组学相关研究技术，并简单介绍了近几年这些技术在生物学中的应用。

关键词：蛋白质相互作用；蛋白互作抑制剂；生物信息学

人类基因组序列早在本世纪初成功解码，生物学领域的研究正式迈入后基因组时代，对基因研究的重心也转移到了翻译后的蛋白质上[1]。蛋白质作为生命活动的主要承担者，在近年来越发地成为研究的热点，而在蛋白质组学方面，对蛋白质的研究多停留在蛋白质间的相互作用(protein-protein interaction，PPI)，蛋白间的互作会产生蛋白质复合体，并且会调控生物体的生命活动，监测蛋白质间的互作是了解生物机制过程的关键。研究表明，许多疾病的诱因都是由于蛋白间的互作引起，如猪繁殖与呼吸综合征、阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症、胰腺癌等等，所以详细的了解并有效的阻断这些蛋白间的互作对于临床疾病的治疗具有重大而深远的意义[2]。随着科学技术手段不断的成熟，蛋白质组学技术也得到了高速的发展，包括双向电泳、噬菌体展示技术、GST pull-down、酵母双杂交、串联亲和纯化、双分子荧光互补技术、蛋白质芯片、Far Western blot、免疫共沉淀等等。

1双向电泳技术

双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)最早是1975年提出用于分离分析蛋白的技术，最初并非是为验证蛋白间的互作，但经过不断的发展及改良，该技术可以同TAP等技术及仪器的协同来进行蛋白互作的验证，结果还可以反映出蛋白翻译后的修饰状态[3]。双向电泳原理是根据预测蛋白的等电点先进行等电聚焦电泳，然后再根据分子质量大小进行SDS-PAGE电泳进行二次分离，经染色得到二维分布的蛋白质电泳图，随后通过图像分析软件来对蛋白质的性质进行分析。该技术优点是可以高分辨，高灵敏的检测出蛋白之间的性质差异。缺点是后期凝胶染色如荧光染料或银染分别需要昂贵的设备或成本，所以实验室大多采用低成本的考马斯亮蓝染色法。

有时，电泳的电解液中成分的改变会对试验造成不良影响，且极端酸/碱性蛋白的筛选相对比较困难，减少或消除这方面不利因素就可以大大提高试验成功率，Guo C G等[4]通过对电解液的改变有效的消除了定量时蛋白质沉淀对试验的干扰，并增加了试验的分辨率(多分辨约16.4%的蛋白质)与灵敏度(较原始方法约提高2.7倍)。此进步有益于复杂蛋白质组的研究，尤其是极端酸/碱性蛋白的分析筛选。而双向电泳与免疫印记法的联用也在寄生虫领域有新进展。Cui J等[5]通过双向电泳及免疫印记成功检测到与旋毛虫表面抗原相关联的15种不同蛋白质，经过筛选，确定其中5个蛋白质与旋毛虫代谢相关并且这5个中的2个蛋白与细胞过程关联。这为阐明宿主-寄生虫相互作用，识别入侵相关蛋白，诊断早期抗原以及设计相关疫苗打下了坚实的基础。

2噬菌体展示技术

该技术最早是由美国Missouri大学的Smith G P建立。在过去的几年里该技术发展迅猛，在各种领域大放异彩，如验证蛋白间互作、临床应用[6]、药物发现[7]、疫苗开发[8]、抗体工程分离技术[9]、表位作图[10]等等。该技术原理是将目的基因完整的阅读框克隆到噬菌体外壳蛋白结构的基因位置，使外源基因与噬菌体外壳蛋白进行融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重组而显示在噬菌体表面。显示的分子或蛋白保持相对独立的结构及活性，肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。噬菌体展示技术系统又可详细分为丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统、T7噬菌体展示系统。此技术优点是筛选高效，操作简单，成本低廉。缺点是拷贝数低，表达量小，并且噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示，限制了分子的多样性。由于噬菌体展示技术操作便利、成本低，很多人热衷于此技术并进行了一定的改良，如Celik E等[11]利用糖阵列设计的噬菌体展示成功建立了高通量检测的多糖 - 蛋白相互作用方法，为大规模筛选及临床应用铺平道路。而近几年报道也充分说明了噬菌体展示技术的广泛应用，如Malini E等[12]使用噬菌体展示技术成功发现了衰老纤维原细胞的染色质上有高迁移率蛋白A(high-mobility group A，HMGA)的相互作用分子及蛋白，还有相互作用的特定氨基酸区域E-R-K，阐述了该技术在验证蛋白间相互作用的高效与敏感。并首次证明了E-R-L区域肽序列结合到HMGA，为研究相关肽与HMGA的相互作用提供依据，并进一步为开发癌症抑制剂(抑制HMGA族蛋白)奠定了坚实的基础。

3GST pull-down技术

此技术目的用来验证在体外蛋白质之间的互作关系，现已经广泛用于分子生物学领域[13]。此技术原理是先构建带有GST标签的融合表达载体，后经过GST亲和纯化柱将蛋白纯化，最后将待测蛋白过柱，若标签蛋白与待测蛋白间有相互作用，待测蛋白就可以结合到柱上，随后经过洗脱就可以得到相互作用蛋白。该技术优点是特异性极高。缺点是无法大规模筛选蛋白间的相互作用，且有些内源性蛋白会干扰试验导致假阳性结果。

GST pull-down技术优势就在于其可以使靶蛋白保持“天然”的状态，活性很高，对于要求活性的互作试验来说意义重大，所以应用极为广泛。Luo L等[14]对GST pull-down技术进行了改进，进一步增加了试验的敏感性，降低背景水平并使蛋白酶裂解步骤更容易。对于有内源性蛋白干扰的GST pull-down 技术来说，蛋白质组学技术间的协作可以使试验结果更准确、更可信。如Wang X等[15]通过GST pull-down协同酵母双杂交、免疫共沉淀等技术证实了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRSV)的N蛋白与PABP之间的相互作用，确定了PABP的调节对于PRRSV复制过程起重要作用，并且为研发PPRSV疫苗提供了理论基础，此外，调查PRRSV细胞增殖蛋白会提高我们对分子级病毒感染病理现象的理解。

4酵母双杂交技术

酵母双杂交最早由Field S等[16]在1989通过转录因子GAL4的研究结果建立。是在体内验证蛋白间相互作用的经典方法。原理是酵母内有2个特殊结构域：特异性结合结构域(binding domin,BD)和转录激活结构域(AD)。这2个结构域即使分开时也仍具有功能，互不影响。当BD结合某段基因需要表达时就必须识别AD进行结合，这样才能转录翻译构成完整的真核表达系统。所以只要将待测的俩个蛋白基因分别连接到AD与BD上，若靶蛋白之间有相互作用则AD与BD就可以结合完成转录并激活下游报告基因，根据报告基因就可以判断互作结果。同时，报告基因的选择建议使用俩种或俩种以上(如ADE2和URA3)，这样可以使试验结果更准确。酵母双杂交的优势在于可以建立cDNA文库，从中大规模筛选与目标蛋白相互作用的多种蛋白，还可以建立基因组蛋白连锁图(genome protein linkage map，GPLM)。酵母双杂交的优点是效率高，蛋白间的瞬时与稳定结合都有良好的敏感性，结果便于观察，最重要的是酵母双杂交是在体内进行，可以有效的排出体外因素的干扰使结果更可信。缺点是不能检测细胞膜、胞浆以及分泌到细胞外的蛋白，另外试验周期略长，而且结果容易出现假阳性，需要进行多重筛选以及回转酵母等试验进行排除。鉴于酵母双杂交技术的高效、敏感，尤其是在酵母体内验证互作排出外界干扰的情况下，酵母双杂交在很多领域大放异彩，如Silva J V等[17]通过对酵母双杂交技术改良验证了磷蛋白与磷酸酶1的相互作用，使其在制药领域发挥作用。Mahajan S等[18]成功建立了衍生于感染口蹄疫病毒的猪肾细胞系(LFBK) 的cDNA文库，并用口蹄疫病毒的2C蛋白做诱饵蛋白，从LFBK的cDNA文库进行酵母双杂交筛选互作蛋白，并深入的研究了口蹄疫病毒与猪肾细胞的关系。最近几年酵母双杂交技术发展迅速，衍生出了单杂交系统、三杂交系统核外双杂交系统、反向双杂交系统、哺乳动物双杂交系统等[19]相信在蛋白质组学领域未来酵母双杂交技术可以发挥更大的作用。

5串联亲和纯化技术

串联亲和纯化技术(tandem affinity purification,TAP)最早是由Rigaut G等[20]提出的接近原始自然状态下测定蛋白互作的方法。最早用于酵母。原理是通过特殊设计的蛋白标签，将其与目标蛋白进行连接且不会对目标蛋白调控造成影响，因此不会对蛋白表达及表达量造成不利，在经过连续俩步的亲和纯化获得活性接近自然状态的蛋白复合物，随后用Edman降解法或质谱技术进行蛋白质鉴定。该方法优点是假阳性率低、周期短、特异性高，可分析复合物中蛋白间稳定以及瞬时结合的互作情况。缺点是TAP标签会影响目标蛋白与亲和柱的结合，并干扰蛋白复合物的活性状态。

TAP的优点是接近原始自然状态下测定蛋白互作，受到很多研究人员的推崇，但标签会在一定程度上干扰试验，如何排除标签带来的干扰对于提升TAP技术有重要意义。Gong W等[21]通过串联亲和纯化与双向电泳技术的结合，并借助电镜等仪器成功发现5个新的立氏立克次体体感诱发电位，尤其是Adr1、Adr2及OmpW都与血管内皮细胞有相互作用。而另一些人则通过对试验本身，通过对标签的改善提高TAP的灵敏度，如Higo T等[22]开发了用于高效标记毕赤酵母中染色体的方法，通过使用串联亲和纯化标签在特定位置进行标记，并用HIS及FLAG序列反标记标签后进行亲和纯化，成功从P.pastoris毕赤酵母中纯化出RNA聚合酶123,为后续快速大规模制备真核生物结晶级多亚基蛋白复合物奠定基础。

6双分子荧光互补技术

双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)最早是由Hu C D等[23]报道的一种准确直观的判断靶蛋白在活细胞中的定位以及相互作用的新技术。双分子荧光互补技术原理为将荧光蛋白(GFP、YFP、CFP等)切开形成N-端与C-末端的俩段不发光的多肽链，然后分别将这俩段多肽链连接到要验证的相互作用的靶蛋白上，当靶蛋白在体内或体外共同表达并相互作用融合，被分割开来的荧光蛋白肽链就可以互补重新连接到一起形成完整的荧光蛋白。该方法优点是简单快速，适用范围广。缺点易出现假阳性与假阴性的结果，需多次重复确定结果。尽管该技术有所限制，但是经过不断的改良，其后更是发展出了多色荧光互补技术(multicolor BiFC)，可以同时对多种蛋白间的相互作用进行验证，并且可以比对蛋白互作程度的强弱，非常便利。

随着BiFC的深入研究和性能的不断发掘，现在可以应用到多种细胞及生物体内的蛋白间互作的研究，并可确定互作在细胞中的发生部位，简单、耗时短使近几年有许多相关报道，如Chen M等[24]通过BiFC检测到了HIV-1与辅助因子蛋白以及上皮衍生生长因子之间的相互作用，并且是一种强的相互作用。这项研究提供了新的蛋白质生理条件下的成像系统，并为抗HIV疗法的蛋白抑制剂类药物研发提供信息。Nickerson A等[25]更是将双分子荧光与PALM相结合，证实了GTPase Ras与Raf之间的相互作用，这个结果在分子级上为Ras/Raf之间的互作调节提供了新的方向。

7蛋白质芯片技术

蛋白质芯片又称蛋白质微列阵，根据制作方法和应用的不同将蛋白质芯片分为2种：①蛋白质检测芯片，类似于较早出现的基因芯片，即在固相支持物表面高度密集的排列探针蛋白点阵，当待测靶蛋白与其反应时，可特异性的捕获靶蛋白，然后通过检测系统对其进行分析，常用的是表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱技术(SELD-TOF-MS)将靶蛋白离子化，直接对其进行定性、定量分析。②蛋白质功能芯片，即样品中待测蛋白在电场作用下通过芯片上的微型孔道进行分离，后经过喷射进入质谱仪中来检测靶蛋白。该技术的优点是简单快捷，高通量，重复性与敏感性好，可以检测一些难以鉴定的低丰度，小分子质量蛋白。缺点是进行大量样品测定时，需制备大量探针，另外芯片与靶蛋白结合特异性不高。蛋白质芯片是近年来发展起来的新兴生物检测技术，经过不断的摸索与完善，该技术已经在生物领域中广泛使用。

目前，很多人着手于蛋白互作的课题，需要高通量、高敏感筛选互作蛋白时，蛋白质芯片技术的优势就体现出来了，如Zhu H等[26]为深层探索酵母蛋白质组，制备了多达5 800种的蛋白质芯片，筛选它们与蛋白质、磷脂质等的互作能力，结果发现了很多新的相互作用蛋白。而通过第二种功能芯片还可以进一步的了解靶蛋白相关功能，如Jiang B等[27]也通过该方法将核因子κB诱导激酶(nuclear factor κB-inducing kinase,NIK)结合到芯片上确定了NIK的负调控可以阻止肝损伤。

8Far Western blot

Far Western blot与Western blot相似，区别在于Far Western blot的一抗用带有标记物的待测蛋白来代替，如果膜上蛋白与带标记蛋白间有相互作用，就可以达到Western blot一抗的效果，最终结果就可以证明目的蛋白间的相互作用，用这种分析方法使用合成肽作为探针检查交互序列(interaction sequences，IS)可以对翻译后修饰蛋白间的互作进行研究，并确定在不使用抗原特异性抗体时的蛋白与蛋白之间的相互作用。该方法优点是灵敏度高，将阳性率低，已经在蛋白质组学中广泛应用。缺点是每个试验需要的单抗如果买不到都要单独制备，成本较高。

对于弱结合的互作来说，该技术未必能准确检测到，但由于技术不断的成熟，使得弱结合也可以准确检测到。Sato Y等[28]通过far Western blot 检测到微弱的蛋白质相互作用并使微弱的条带得到增强。通过该方法检测俩种蛋白质之间是否有稳定结合互作，如果是瞬时结合，可以用候补蛋白进一步检查，确保结果的准确性，为瞬时结合不易被检测到的问题进行了优化。近几年该技术不断改进，由于其试验方便、快捷，使其应用频繁，有关报道如Liu Q H等[29]使用far Western blot证明了南美白对虾核衣壳蛋白VP51与核糖体蛋白L7的相互作用，同时说明了L7参与对虾白斑综合(White spot syndrome,WSSV)感染，为进一步研究探索L7在WSSV作用机制打下基础。

9免疫共沉淀

免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)是根据抗原抗体专一性验证蛋白之间相互作用的经典手段。该技术的原理是使用非变性剂对细胞进行裂解，这样原细胞内的相互作用蛋白会很完整的保留下来，随后加入靶蛋白的对应抗体使之形成抗原抗体复合物沉淀，这样与靶蛋白在细胞内相互作用的蛋白也会一同被沉淀下来，故称免疫共沉淀。该技术优点是保持了蛋白的天然状态，真实的反应互作结果。缺点是不易检测到瞬时以及不稳定的互作关系(因为瞬时以及不稳定的互作无法形成稳定的沉淀)，且由于蛋白并未经过纯化所以不能证明蛋白间的相互作用是直接的还是间接的。

当确定某种互作关系后，形成的复合物的功能和性质也将成为研究的目标，而复合物的作用机制也需进一步探究。Bilusic I等[30]通过免疫共沉淀检测到大肠埃希菌RNA分子伴侣(host factor for RNA phage QB replicase,HFQ)与体内许多sRNAs的结合并确定了25种新型RNA，另通过Northern blot发现了与HFQ结合的RNA形成的复合物均受HFQ的调控。Co-IP一般用于俩俩间的蛋白互作验证，无法大规模进行验证，而凌梦婷等[31]以液相色谱-质谱联用法(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS/MS)鉴定技术为基础，通过Co-IP大规模的筛选了45个与HBV病毒POL蛋白的互作蛋白，其中有11个已经有过报道，在这些蛋白中有4种蛋白可能参与了3种主要分子机制，为进一步探索HBV蛋白功能结构提供理论依据，也看出蛋白质组学技术间的联用可以对试验有很大改善。

10BIAcore

在蛋白质组学技术不断更新换代时，相关仪器设备也在不断改良，测定偏向于蛋白互作弱结合的仪器设备是奥弗豪塞尔核效应(nuclear overhauser effect,transfer-NOE)和等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC)，偏向于测定强的蛋白互作比较流行的便是以表面离子共振(surface plasmon resonance,SPR)技术为基础的生物分子相互作用分析(Biomolecular interaction analysis,BIAcore)，这里着重介绍BIAcore。

Amersham Bioscience公司是实现该技术商业化最成功的公司，其推出的仪器商品即为BIAcore,现有BIAcore1000/2000/3000/X等产品系列，BIAcore系统由微射流卡盘、传感器芯片和SPR光学检测系统3个核心部分组成，它的工作原理是基于SPR技术来实时追踪生物分子间的相互作用。试验开始是先将一种生物分子固定在传感器芯片表面，再通过微射流卡盘将待测相互作用的分子溶液传送至传感器芯片表面，SPR光学检测系统则跟踪检测溶液与芯片表面的分子结合和解离的全过程，试验过程中获取的各种特异性信号全部通过数据分析软件BIAEvaluation处理，并整合成最终结果。在超过17年的时间里，BIAcore 系统为科学家们提供了独到的洞察力来揭示蛋白质的相互作用，发表文献超过6 500篇，而近几年国外也不断有应用BIAcore来进行蛋白互作验证的例子[32-33]。由于其高度的自动化和灵敏特异性且具常规仪器方法难以比拟的实时、动态监测优点，而且该仪器可以与质谱技术相结合使用，使BIAcore广泛地应用于蛋白质组学领域的研究。

11小结与展望

蛋白质之间的互作是直接的还是间接的，瞬时的还是缓慢的，强结合还是弱结合，这些都与生物体内机制息息相关，探究蛋白间的互作对于进一步了解生物体机制有着深远的意义。蛋白间互作的抑制剂(protein-protein interact inhibitors, PPIIs)由此产生，通过对蛋白互作的阻断达到病毒机制“失活”的效果，发挥抗病毒作用使临床疾病得以完善治疗，而最近几年抗病毒药物的快速研发也说明了PPIIs有发展成为抗癌药物的潜力[34]。目前对于少量的蛋白互作检测多用几种方法协同验证，力求结果精准。而对于未知的物种间蛋白的互作，则可以借用生物信息学来进行初步筛选判断，既可节约时间也可增加试验成功率。在过去的几十年不仅蛋白质组学技术飞速发展，蛋白质组学的生物信息学也崭露头角，笔者将国内与国外的部分蛋白质互作生物信息学相关的蛋白质组数据库进行了整合[35-36](表1)。

可见生物信息学在蛋白质组学中也占据了举足轻重的地位，很多实验室都将生物信息学与蛋白质组学技术相结合获得更精确的结果。相信在未来蛋白质组学研究重心将继续向蛋白质的互作研究发展并且协同生物信息学会在生命科学领域突飞猛进，为探索临床疾病发生机制指明新方向。

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兽医临床

Protein-protein Interaction Technology

WU Jian1,2,ZHU Hai-xia1, ZHAO Zhi-xun1, YAN Xin-min1,ZHAO Yin-long3, WU Na1,LI Jian1,ZHANG Zhi-dong1, ZHANG Qiang1, LI Ying2, WU Guo-hua1

(1.StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology/LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Lanzhou,Gansu,730046,China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgricultureUniversity,Changchun,Jilin,130118,China;3.AcademyofLifeScienceandTechnology,NorthwestUniversityforNationalities,Lanzhou,Gansu,730124,China)

Abstract:Protein in the mechanism of the organism is essential as a start within biological systems and perform tasks. Every biological step of the organism, from the genetic material copy to the cell aging and death, depends on a few or even hundreds of protein function coordination. The protein function and structural changes will destroy this balance, leading to the occurrence of disease, usually as a result of protein-protein interactions. There are still a lot of structures and functions of the proteins unknown, so it is particularly rapid in development of proteomics. This article reviewed the proteomics technologies,such as 2-DE, phage display technology, GST pull-down, yeast two-hybrid system,TAP,BiFC, protein chip, Far Western blot,Co-IP,and introducted the application of these technologies in biology in recent years.

Key words:protein-protein interaction; protein-protein interaction inhibitor; bioinformatics

文章编号:1007-5038(2016)02-0109-07

中图分类号:S852.2

文献标识码:A

作者简介：吴健(1990-)，男，吉林长春人，硕士研究生，主要从事分子免疫学研究。

基金项目：国家质检总局公益性行业科研专项(201310093)；国家自然科学基金项目(31201892)；甘肃省自然科学基金项目(1208RJZA101)；国家863计划项目(2012AA101304)；甘肃省科技资助计划项目(1504WKCA055)

收稿日期：2015-04-29