帕立骨化醇预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的作用

郝立校，蔡珍福，周玉坤，王坚，陈莉(中国人民解放军第四五五医院肝胆外科，上海200052)



帕立骨化醇预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的作用

郝立校，蔡珍福，周玉坤，王坚，陈莉
(中国人民解放军第四五五医院肝胆外科，上海200052)

[摘 要]目的 探讨帕立骨化醇预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用及合理剂量。方法 300只健康雄性SD大鼠随机分为:假手术组、模型组、实验1组、实验2组、实验3组，每组60只，各实验组分别于肝缺血再灌注手术前24 h腹腔注射0.15、0.30、0.60 µg/kg帕立骨化醇。每组取20只大鼠于术后3、6、12和24 h取尾静脉血，并观察各组此20只大鼠术后24、48、72 h的生存率。各组另40只大鼠分别于术后3、6、12、24 h每个时间点处死10只大鼠，取肝组织。比较各组大鼠存活率和术后谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及肝脏组织丙二醛(MDA)含量。结果 模型组大鼠存活率低于假手术组(P＜0.05)，实验各组大鼠存活率高于模型组；除实验1组与模型组相比无统计学意义外，其余各实验组在术后3、6、12、24 h与模型组相比ALT均有下降(P＜0.05)；而术后3 h起实验1、2、3组AST水平均低于模型组(P＜0.05)。术后3、6、12、24 h，各实验组肝组织MDA均低于模型组，实验2组和3组与实验1组差异具有统计学意义(P＜0.05)，实验2组与实验3组间差异无统计学意义(P＞0.05)。结论 帕立骨化醇预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤具有保护作用，0.15 µg/kg即可以明显改善模型肝功和肝脏MDA水平，但0.30 µg/kg以上水平效果更佳。

[关键词]帕立骨化醇；肝脏缺血再灌注损伤；谷丙转氨酶；谷草转氨酶；丙二醛

Pretreatment effect of Paricalcitol on hepatic ischemia-reperfusion injury in rats HAO Li-xiao, CAI Zhen-fu, ZHOU Yu-kun, WANG Jian, CHEN Li.Department of Hepatobiliary Surgery, the 455thHospital of People’s Liberation Army, Shanghai 200052, China

Abstract ObjectiveTo explore the pretreatment effect of paricalcitol on hepatic ischemia reperfusion damage and explore reasonable dosage.MethodsThree hundred healthy male SD rats were randomly divided into sham group (n=60), model group (n=60), test 1 group (n=60), test 2 group (n=60) and test 3 group (n=60).Rats of test group were intraperitoneal injection with 0.15 µg/kg, 0.30 µg/kg, 0.60 µg/kg of Paricalcitol respectively 24 h before reperfusion.Twenty rats’ venous blood samples were taken at 3, 6, 12, 24 h after operation in each group, and the survival rates were observed at 24 h, 48 h, 72 h after operation.Ten of the other forty rats were sacri■ced for liver tissue at 3, 6, 12, 24 h after operation in each group.All groups of rats were compared with the survival rates, levels of ALT, AST and MDA in liver tissue.ResultsThe survival rate in model group was lower than that in sham group (P＜0.05), survival rate of all test groups 1, 2 and 3 was signi■cantly lower than that in model group (P＜0.05).Except test group 1, ALT levels of test 2 and 3were lower than that in model group 3 h postoperative (P＜0.05).Levels of AST in test group were lower than the model group 3 h postoperatively (P＜0.05).Levels of MDA in liver tissue in test groups 1, 2 and 3 were lower than model group 3～24 h postoperatively.Levels of MDA in liver tissue test group 2 and 3 showed statistically difference (P＜0.05) with that in test group 1, but levels of MDA in liver tissue showed no signi■cant difference between test group 2 and 3 (P＞0.05).ConclusionParicalcitol pretreatment possesses protective effects on hepatic ischemia-reperfusion injury.Dosage of 0.15 µg/kg can obviously improve the model and hepatic MDA level, and more than 0.30 µg/kg level affects better.

Key words Paricalcitol； hepatic ischemia-reperfusion injury； ALT； AST； MDA

肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemiareperfusion，HIRI)的发生与缺血再灌注过程中氧自由基释放、肝脏能量代谢障碍、细胞内钙离子超载、微循环功能障碍、细胞因子、线粒体功能异常、Kupffer细胞激活及中性粒细胞的活化等因素有关[1-3]。但迄今为止，临床常采用药物防治、低温、药物预处理或进行基因治疗等策略尚未妥善解决临床肝脏缺血再灌注所致的肝功能不全。有研究表明在肾缺血再灌注的治疗中帕立骨化醇具有抗氧化、提高HSP70的表达、并影响肾细胞凋亡的作用，从而明显减少肾IRI的发生[4]。但帕立骨化醇是否对肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用尚无研究。本实验研究不同剂量帕立骨化醇预处理对大鼠HIRI的影响，并初步探讨其作用的相关机制。

1　材料和方法

1.1分组和造模

分组:健康雄性SD大鼠300只，体重220～250 g，采用随机数字表法分为:假手术组、模型组组、实验1组、实验2组、实验3组，每组60只。

给药:各实验组于手术前24 h分别腹腔注射0.15、0.30、0.60 μg/kg相同浓度帕立骨化醇注射液(意大利HOSPIRA.S.P.A.，规格1 mL:5 μg)，模型组和假手术组未用药。

造模:模型组和实验组采用Yoshizumi等[5]的方法造模，游离Glisson氏系统进入肝左叶和中叶的分支，用无创血管夹钳夹进入肝左、中叶的分支，造成肝左、中叶约70%肝脏热缺血，保持肝右叶及尾状叶血流通畅，关腹缝合切口，夹闭60 min后再次入腹，然后松开夹闭使血液复流进行再灌注的方法制备大鼠肝缺血再灌注模型。假手术组仅暴露肝门，不夹闭动、静脉。

1.2样本收集和指标检测

1.2.1 血清样本:每组取20只大鼠于术后3、6、12 和24 h取尾静脉血约1 mL，离心机离心后取血清送全自动生化分析仪检测ALT、AST含量。并观察各组此20只大鼠术后24、48和72 h生存率，并记录感染、出血、死亡等可能的并发症情况，死亡鼠行解剖查找原因。1.2.2 肝脏组织样本:各组另40只大鼠分别于术后3、6、12和24 h各组处死大鼠10只(模型组于12 h死亡1只大鼠、24 h死亡2只大鼠；实验1组于12 h死亡1只大鼠、24 h死亡1只大鼠；实验2组和3组无大鼠死亡)，每只大鼠取2份肝组织，一份肝组织在10%甲醛溶液中固定72 h后常规石蜡包埋切片，常规HE染色。另一份肝组织冷冻于-20 ℃低温冰箱，采用硫代巴比妥酸(Thiobarbituricacid，TBA)法测定丙二醛MDA。

1.3统计学分析

研究数据采用SPSS 21.0软件包进行分析。计数资料以率表示，组间比较采用卡方检验，计量资料(±s)表示，采用方差分析(SNK检验)对同一时间点各组的同一指标进行比较，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1大鼠生存情况、ALT、AST比较

各组大鼠存活率比较见表1。实验各组大鼠存活率明显高于模型组，实验1组在48 h后存活率与模型组组差异有统计学意义(P＜0.05)，实验2组和实验3在24 h后存活率与模型组组差异即有统计学意义(P ＜0.05)，但实验1、2、3组间差异并无统计学意义(P ＞0.05)。死亡大鼠解剖后共同特征是:胃内容物多、肠道明显积液，腹腔积血。

表1　各组大鼠存活率比较

术后6 h模型组ALT水平升至最高，与假手术组差异具有统计学意义(P＜0.05)，术后3 h起实验各组ALT水平与模型组相比即具有下降趋势，但术后3 h时仅实验2、3组与模型组差异具有统计学意义(P＜0.05)，实验1组差异无统计意义(P＞0.05)，术后24 h时实验1、2、3组与模型组相比差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

术后6 h模型组AST水平升至最高，与假手术组比差异均具有统计学意义(P＜0.05)，术后3 h起帕立骨化醇低、中、高剂量组AST水平与模型组相比具有下降趋势，(P＜0.05)，且至术后24 h时，此趋势仍然存在(P＜0.05)，虽然高剂量组AST水平低于中、低剂量组，但差异并无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

2.2大鼠肝脏组织HE染色、MDA含量情况比较

假手术组(图1A):均正常。模型组(图1B):见肝细胞膜破裂明显，大量胞质空泡形成，淤血及大量炎性细胞浸润，组织损伤随缺血再灌注时间的延长愈加明显。实验1、2、3组(图1C～E):损伤较模型组轻，有少量炎细胞浸润，尤其是实验3组与模型组相比，肝损伤明显减轻。

术后3 h模型组大鼠肝脏MDA水平升至最高，此时实验各组大鼠肝脏MDA均低于模型组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，且实验3组降低水平最明显，此差异至术后24 h时仍然存在，且术后24 h时高、中剂量与低剂量间差异具有统计学意义(P＜0.05)，但高、中剂量间差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表2　各组动物不同时间ALT、AST比较(U/L)

图1　术后各组6 h大鼠肝脏病理组织图片(HE，×200)

表3　各组大鼠不同时间肝脏MDA含量比较(nmol/mg)

3　讨论

肝脏缺血再灌注是肝脏外科的常见病理生理过程，其在休克复苏、肝脏移植、肝叶切除等手术过程中不可避免，影响预后。因此预防或减轻损伤是目前的研究热点。ALT及AST是评判肝脏缺血再灌注损伤的良好指标，分别与肝细胞膜损伤、线粒体受损有关。有研究[6]用大鼠行肝脏缺血再灌注损伤实验，结果发现再灌注80 min血清中ALT、AST水平即急剧上升，可达正常时的10倍以上。自由基可引起剧烈的氧化应激反应，导致细胞受损、死亡。作为脂质过氧化的重要参数，MDA常用来评价肝脏缺血再灌注过程氧自由基符合程度，并指示和预测随后的器官损伤程度。

维生素D3的临床价值是近年来多项研究的热点，Seif等[7]认为，维生素D3能够明显改善缺血再灌注肝脏ALT和AST水平。帕立骨化醇与维生素D3有相似的生物学效应，且副作用比维生素D3小，特别是对钙代谢影响较低。为研究对帕立骨化醇对肝脏缺血再灌注损伤作用并探讨其合理剂量，我们设计了此次实验。

在大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型建立时考虑到钳夹大鼠门静脉和肝动脉可造成全肝缺血，会引起肠道大面积淤血，易导致大鼠死亡。本实验采用的是70%肝脏缺血模型，即钳夹进入肝脏左、中叶的管道造成缺血再灌注损伤。与假手术组比较，HIRI后模型组ALT、AST及MDA水平明显升高，肝组织病理损伤明显，与以往的研究吻合[8-9]。从大鼠存活率看，HIRI可引肝脏缺血同时也易引起肠道淤血，导致部分大鼠死亡，而帕立骨化醇，特别是中高剂量可提高HIRI大鼠存活率。而与模型组相比，帕立骨化醇能显著减少肝损伤大鼠ALT、AST和MDA水平。HE染色可见，与模型组相比，帕立骨化醇处理各组大鼠肝脏病理主要表现为汇管区炎症细胞聚集、肝细胞变性、坏死，而肝小叶组织结构完整；缺血再灌注组则表现为广泛的肝细胞变性、坏死，可见部分肝小叶结构破坏，整体表现为较重的病理损害，这说明帕立骨化醇能起到对HIRI大鼠肝功能和组织形态学的保护作用，抑制缺血再灌注后氧自由基的对肝脏的损伤。在剂量上，无论从大鼠存活率、肝功能水平，还是HE染色、MDA水平看，术前24 h注射的三个剂量(0.15、0.30、0.60 μg/kg)，中、高剂量组对HIRI大鼠保护作用更佳。从作用起效时间来看，各用药组术后AST、ALT及MDA水平在术后3 h即可见到明显恢复，不同剂量间的作用存在差异，出现在术后6 h和术后12 h，术后24 h剂量间差异基本消失。说明中、高剂量能够在更短时间内达到保护效果，但如果是较低剂量的话，足够长的时间也能获得类似效果。这可能与药物的半衰期及药物在机体内的蓄积有关，但考虑到临床治疗的时效性，我们并不建议以较低剂量进行长时间治疗，而推荐以中、高剂量进行短时间冲击治疗，以获得更为满意的治疗效果。

本研究通过不同剂量帕立骨化醇对肝脏缺血再灌注损伤进行预处理，发现其在肝脏缺血再灌注损伤保护上具有较高价值。我们希望，更多同行能够参与这一研究，以进一步明确其作用及机制，从而为临床治疗和预防肝脏缺血再灌注损伤提供更为有效的方法和途径。

参考文献:

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(本文编辑:张海燕，鲁翠涛)

·论著 基础研究·

作者简介][第一郝立校(1978-)，男，河北临城人，主治医师，硕士。

[基金项目]解放军第455医院院内课题(2014YG003)。

[收稿日期]2015-05-26

[中图分类号]R575； R453.9

[文献标识码]A

DOI:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.01.012