水涝胁迫下欧李丙二醛和氧自由基的变化

张海平+程小爱

摘    要：对水涝胁迫下欧李丙二醛和氧自由基含量变化进行初步研究，以期获得欧李植物在成都地区的生长情况，为探讨欧李植物的抗逆性提供理论基础。以双组份分光度法测定丙二醛的含量，提取液与TBA在沸水浴中反应后，分别测定450，532和600 nm波长下的吸光度值;利用O-2.与羟胺反应生成NO2-，NO2-在对氨基苯磺酸和a-萘胺作用下，生成粉红色的偶氮染料，检测植物叶片中O-2.含量。结果显示，水涝胁迫下欧李生长期中，丙二醛含量呈上升趋势;水涝胁迫下欧李氧自由基含量也增加。研究认为随水涝胁迫程度的增加，欧李内氧自由基含量增加，氧化脂膜，导致丙二醛含量增加。

关键词：欧李;丙二醛;膜脂过氧化;氧自由基;水涝

中图分类号：S793.9           文献标识码：A          DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.12.004

Changes of Malondialdehyde and Oxygen Free Radicals in Prunus humilis Bunge Leaves under Waterlogging Stess

ZHANG Hai-ping1， CHENG Xiao-ai2

（1. Dingxiang County State Forest， Shanxi Province， Dingxiang， Shanxi 035400， China; 2. Taigu County Agricultural Commission， Shanxi Province， Taigu， Shanxi 030800， China）

Abstract： MDA and oxygen free radicals were determined to obtain the growing state of Prunus humilis Bunge under waterlogging stress and provide theoretical basis for stress tolerance of Prunus humilis Bunge in Chengdu. The content of MDA was detected by two-component spectrophotometry method. The absorbance at 450， 532 and 600 nm were determined after the extract and TBA reacted in the boiling water bath; the content of O2-. was detected through pink azo dyestuffs which were obtained by the reaction of O2-. and hydroxylamine to gain NO2-， NO2- then reacted with sulfanilic acid and a-naphthalene amine. The results showed that the content of MDA and O2-. were all increased during the waterloggin. The contents of oxygen free radicals increased and caused bilayer lipid membrane oxidation; the contents of MDA also increased during the waterlogging because MDA was the product of bilayer lipid membrane oxidation.

Key words： Prunus humilis Bunge; malondialdehyde; membrane lipid peroxidation; oxygen free radicals; waterlogging

欧李[1]（又称钙果）Prunus humilis Bunge为蔷薇科樱桃属矮生樱桃亚属的一种野生灌木果树，主要分布在中西部的山西、河北、陕西、内蒙等干旱地区。植株高0.3～1.5 m，抗寒，耐旱，适应性强。经济价值极高，用途非常广泛。可食用，仁可入药，茎可作饲料。果实呈红色，呈扁圆形、枣圆形、尖桩形不等，酸甜适中，味道可口，富含维生素A、维生素B2、维生素B12、维生素C、维生素E，微量元素氮、钾、钙、铁、锰、镁、锌、硒等，而且含有多种氨基酸，果实含糖量可达13%～19%。在环境设计、水土流失防治等方面作用较好，被列为生态林优良树种。

随着植物叶片的衰老[2]，植物中各项生理指标会有变化，如核酸和蛋白质含量减少[3]、光合作用降低、叶绿素降解以及激素平衡失调等。这些指标可以反映植物衰老过程的变化。

自由基从产生到衰亡的过程就是电子转移的过程[4]。在生命体系中，电子的转移是一种基本的运动，生物体内的氧最容易得到电子形成活性自由基。

代谢的氧大多数与氢结合生成水，4%～5%形成超氧阴离子，后者又可形成过氧化氢，它们都属于自由基[5]。自由基有多种，如氧自由基，是指那些最外层电子轨道[6]原子、离子或分子。自由基具有高度的氧化活性，它们很不稳定，活性很高，它攻击细胞膜等膜类，与膜中的不饱和脂肪酸[7]反应，造成脂质过氧化增强。脂质过氧化产物又可分解为更多的自由基，引起自由基的连锁反应。这样，膜结构的完整性就遭到了破坏。目前发现的氧自由基基本上对植物是起负作用的。

通过呼吸作用进入生物体内的氧分子，参与酶促或非酶促反应[8]时，只接受一个电子后转变为超氧阴离子自由基（O-2.），O-2.既能与体内的蛋白质和核苷酸等活性物质直接作用，又能衍生为H2O2，羟自由基（.OH），单线态氧（1O2）等。.OH可以引发不饱和脂肪酸脂质（RH）过氧化反应。产生一系列自由基，例如：脂质自由基（.R）、脂氧自由基（O-2.）、脂过氧自由基（ROO.）等。基团旁边的小圆点为不成对价电子，这种基团称为自由基，带有—O—O—的是过氧化物，1O2d的电子处于激发状态。这些含有氧而比O2活泼得多的化合物，称为活性氧，部分人将它们统统归纳为氧自由基类。一切需氧生物均能产生活性氧，在其体内有一套完整的活性氧清除系统（抗氧化酶和抗氧化剂[9-10]），能将活性氧转变为活性较低的物质，基体因此受到保护。利用羟胺氧化[11]的方法可以检测出生物系统中O-2.含量。

自由基清除能力则随年龄的增加而减少，有时甚至不能消除O-2.。O-2.反应能力很强，可使细胞中的多种物质发生氧化，活性氧大量积累会引发或加剧细胞膜脂过氧化作用产生MDA[12]。MDA产生则进一步加剧细胞膜的损伤，并造成细胞膜系统的损害。所以，丙二醛产生数量从一定程度上代表细胞膜脂过氧化的程度，也可以间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。

1 材料和方法

1.1 试验材料和仪器

1.1.1 植物材料 试验材料为2008年从山西引种到成都的欧李。3月份移栽至花盆中，正常管理。设计为8株长势相同的欧李，分为2组：处理组和对照组，处理组用水涝胁迫处理，对照组为正常条件下进行连续168 h的观测。

1.1.2 药品与试剂 试验药品：三氯乙酸、硫代巴比妥酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、石英砂;试剂：亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、a-萘胺、盐酸羟胺及缓冲液，所用试剂都是分析纯。

0.05 mol·L-1 pH 值7.8磷酸钠缓冲液：先各配制0.05 mol·L-1的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，将两者体积按照91.5∶8.5混合，得到目标溶液。

5%三氯乙酸溶液：称5 g三氯乙酸固体，先溶解再定容至100 mL。

0.5%硫代巴比妥酸溶液：称取0.5 g硫代巴比妥酸，用5%三氯乙酸溶解，定容至100 mL，得到目标溶液。

1.1.3 试验仪器 CT15RT型高速冷冻离心机，上海天美生化仪器设备工程有限公司;7200 型可见光分光光度仪，尤尼柯（上海）仪器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅，常州澳华仪器有限公司;FA2004B型电子天平，上海越平科学仪器有限公司;冰箱， 海尔;电热鼓风干燥箱（DB-210SCB/3kW），成都天宇实验设备有限公司;研钵;剪刀; 5 mL刻度离心管;刻度试管（10 mL）;镊子; 移液管（5，2，1 mL）。

1.2 试验方法

1.2.1 丙二醛含量的测量 （1） 丙二醛的提取。分别取欧李当年生枝条叶片，洗净擦干，剪碎，分别称取0.2 g左右于预冷过的研钵中，同时加入少量石英砂，2 mL预冷的0.05 mol·L-1 pH值7.8的磷酸缓冲液，在冰浴下研磨成匀浆，转移到5 mL刻度离心试管，用3 mL缓冲液分3次洗净研钵，清洗液合并到离心管中，于8 000转·min-1，4 ℃下离心15 min，取上清液即为丙二醛缓冲溶液。

（2）丙二醛含量的测定。收集上清液用磷酸缓冲液定容到7 mL，从中取1 mL，加入5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，摇匀。将试管放入沸水浴中煮沸10 min（自试管内溶液中出现小气泡开始计时）。10 min后立即将试管取出并放入冷水浴中，冷却后，再次在4 ℃、8 000 g离心15 min（试管中若没有沉淀，可不离心）。离心后，以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白分别测定532，600 和450 nm处的吸光值。

（3）丙二醛的数据处理方法。本试验采取的是双组分光光度法，丙二醛的浓度的计算方法为

MDA浓度（μmol·L-1）=6.45（D532-D600） -0.56D450

式中，D450、D532、D600分别代表450，532和600 nm波长下的光密度值。

MDA含量（μmol·g-1，FW）=MDA浓度（μmol·L-1） ×提取液体积（mL）/植物组织鲜质量（g）

1.2.2 氧自由基的测量 （1）亚硝酸根准曲线的制作。最先配置出浓度50 μmol·L-1的NaNO2，再稀释得到梯度浓度5，10，20，25，30，35，40，50 μmol·L-1。然后取1 mL NaNO2溶液，分别加入1 mL 17 mmol·L-1对氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol·L-1 a-萘胺，1 mL H2O，于250 ℃中保温20 min，然后测定OD530，结果如表1。以[NO2-]和OD530值互为函数，按照试验条件用计算机做标准曲线，得出回归方程和相关系数，如图1。

（2）植物提取液的制备。取欧李植物本年生叶，洗净擦干剪碎，加入2 mL的50 mmol·L-1 pH 值7.8磷酸缓冲液[含0.1 mmol·L-1 EDTA;0.3%（W/V）Triton X-100;4%（W/V）聚乙烯局吡咯烷酮（pvpp，polyvinylpolyrrolidone）]进行研磨，研磨后加1mL 50 mmol·L-1 pH值7.8磷酸缓冲液洗研钵2次，以10 500×g离心20 min，得上清液并用缓冲液定容到8 mL，即为粗酶液。

（3）测定氧自由基含量。从粗酶液取1 mL，加0.5 mL 50 mmol·L-1 pH值7.8磷酸缓冲液，1 mL 1 mmol·L-1盐酸羟胺，摇匀，于250 ℃中保温1 h，然后再加入1 mL 17 mmol·L-1对氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol·L-1 a-萘胺（冰醋酸∶水=3∶1），摇匀，于250 ℃中保存20 min，取出测定波长OD530。

根据测得的OD530，查亚硝酸根标准曲线图，将OD530换成亚硝酸根，然后依照羟胺与O-2.的反应式：NH2OH+2 O-2.+H+→NO2-+H2O2+H2O将[NO2-]乘以2，得到[O-2.]含量。

（4）计算亚硝酸根含量和氧自由基含量。由图1（亚硝酸根标准曲线）可知，在选定工作范围内，亚硝酸根线性关系良好。亚硝酸根含量计算公式：

亚硝酸根含量=由标准曲线算得亚硝酸根浓度（μmol）×8（mL）提取液总量/  （样品质量（g）×1.0测定时提取液总量 （mL））  （1）

氧自由基含量=公式1算得的亚硝酸根含量×2 …4（2）

2 结果与分析

2.1 确定试验方法

2.1.1 丙二醛测定方法的优化 方法一：取0.2 g左右样品，洗净擦干，剪成小段放入研钵，加2 mL预冷的0.05 mol·L-1磷酸缓冲液，加入石英砂，冰浴条件下研磨成匀浆，转移到试管，用3 mL缓冲液分3次洗净研钵，清洗液并入试管中。

向试管中加入5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，摇匀。放入沸水浴中煮沸10 min（内液出现气泡开始计时）。10 min后，立即将试管取出并放入冷水浴中，冷却，4 ℃、8 000×g离心15 min。离心后，以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白测450， 532和600 nm处的吸光值。通过此方法得到如表2的数据。

一般吸光度在0.2～0.8之间，可以减少系统误差。此方法测出的吸光度太大，不宜作为试验数据。说明浓度太高，需要稀释提取液。

方法二：同上，只是先把研磨得到的提取液定容到20 mL，取5 mL与0.5%硫代巴比妥酸（TBA）来反应。通过此方法得到如表3的数据。

可以看出此方法测出的吸光度偏大，不可作为试验数据。说明需要离心。

通过以上的2个试验分析，出现这种问题的可能原因在于合并提取液的时候，应该先离心，再反应。

方法三：同方法一，只是定容的时候定到7 mL，从中取1 mL与0.5%硫代巴比妥酸（TBA）来反应，通过此方法得到如表4的数据。

从表4中的吸光度可以确定此方法适宜测定欧李叶片中的丙二醛含量，具体如下。分别取植物当年生枝条叶片0.2 g左右，洗净擦干，于预冷的研钵剪成小段，加2 mL预冷的0.05 mol·L-1 pH 值7.8的磷酸缓冲液，同时加石英砂，在冰浴下研磨成匀浆，转移到5 mL刻度离心试管，将研钵用3 mL缓冲液分3次洗净，清洗液并入离心管中，在8 000转·min-1，4 ℃下离心15 min，上清液即为丙二醛提取液。将上清液用磷酸缓冲液定容到7 mL，取1 mL提取液，加入5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，摇匀，在沸水浴中煮沸10 min（试管内出现小气泡开始计时）。10 min后立即将试管取出并放入冷水浴中冷却，试管中若有沉淀，按上述条件离心15 min。以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白分别测定532 nm、600 nm和450 nm处的吸光值。

2.1.2 氧自由基测定影响因素的排除 （1）叶绿素影响。如果叶片中含有大量叶绿素将干扰测定，可在样品测定时先去掉叶绿素，再进行测定试验。去除叶绿素的过程可在研磨后进行，也可以在样品与羟胺温浴后萃取。在此过程中，提取液总量为2 mL，其他测定条件不变，结果如表5。

通过分析可以知道，不做处理的试验组，结果较一致，而除去了叶绿素的试验组，得到的氧自由基含量相差很大，因为在用乙醚萃取叶绿素的时候，体积影响很大，造成试验结果误差大。不做处理的样品得到的氧自由基相对稳定，因此试验中不考虑叶绿影响。

（2）体积影响。由于要经过研钵研磨，研磨后在研钵上都会留下一定的样品，使得样品提取液不为2 mL，这对试验测定可能造成较大误差，因此对体积影响做了试验。一个是研磨时加2 mL 50 mmol·L-1 pH值 7.8磷酸缓冲液后直接离心，其余条件不变。另一个是在加入2 mL 50 mmol·L-1 pH值 7.8磷酸缓冲液后用1 mL 50 mmol·L-1 pH 值7.8磷酸缓冲液清洗2次，离心后定容到4 mL，结果如表6。

通过分析得到，从同一条件下取得的叶子，不考虑体积影响测定的氧自由基含量值较小，消除体积影响后测出来的氧自由基含量值较大。这表明体积对氧自由基含量测定有影响。所以确定此试验在操作方法中采用消除体积影响的条件。

通过试验，经过分析，决定在试验中不考虑叶绿素的影响，要考虑体积的影响。

2.2 短期水涝胁迫下丙二醛的含量变化

通过测欧李丙二醛生长期变化（11左右点取样，每次做3个平行），测得丙二醛数据。由图2可知，经过水涝处理的欧李丙二醛含量在短期内都比正常生长的欧李丙二醛含量高，说明水涝胁迫确实可以促使欧李产生丙二醛。在水涝胁迫下，短期内丙二醛含量总体呈上升趋势，说明短期内水涝胁迫程度与欧李丙二醛含量呈正相关关系。

2.3 短期水涝胁迫下氧自由基的含量变化

由表7、图3可以看出，胁迫处理组每天的氧自由基含量都要比对照组的要高，说明水涝胁迫可以促使欧李产生氧自由基。随着时间增加，水涝胁迫程度加剧，氧自由基含量呈上升趋势，但是上升过程有波动，这是因为植物体内有自己的一套清除系统（抗氧化酶和抗氧化剂）[13]。当植物受到胁迫，体内会产生POD，POD的主要作用就是分解氧自由基[14]，而在胁迫下，氧自由基增加，相应的POD也会增加，但是氧自由基的产生能力在短时间胁迫下比POD分解能力要强，故在短时间内，欧李氧自由基含量呈波动上升的趋势。

3 结论与讨论

3.1 短期水涝胁迫下欧李丙二醛含量变化趋势

短期内，水涝胁迫下欧李丙二醛的含量比正常生长的要高。这是因为植物受到水涝胁迫会产生氧自由基，而氧自由基作用就是氧化细胞脂膜，其产物就含有丙二醛。同时从本试验还可以看出，在本试验条件下，丙二醛的含量呈上升趋势。在短期内，随着水涝胁迫时间的增加，对植物的胁迫程度也增加，植物氧自由基量增加，导致脂膜氧化一直进行，丙二醛含量呈上升趋势。

3.2 短期水涝胁迫下欧李氧自由基含量变化趋势

短期内，水涝胁迫下欧李氧自由基的含量比正常生长的要高，说明水涝胁迫有利于欧李产生氧自由基。水涝胁迫程度加剧，氧自由基含量将呈上升趋势，但是上升过程有波动，这是因为植物体内有自己的一套清除系统（抗氧化酶和抗氧化剂）。当植物受到胁迫时，体内会产生POD，POD的主要作用就是分解氧自由基，而在胁迫下，氧自由基增加，相应的POD也会增加，但是氧自由基的产生能力在短时间胁迫下比POD分解能力要强，故在短时间内，欧李氧自由基含量呈波动上升的趋势。

参考文献：

[1] 马建军，张立彬.野生欧李生长期矿质营养元素含量的变化[J].园艺学报，2004，31（2）：165-168.

[2] 宋纯鹏.植物衰老生物学[M].北京：北大出版社，1998：33.

[3] 沈成国.植物衰老生理与分子生物学[M].北京：中国农业出版社， 2001：22.

[4] 陈瑗，周玫.自由基与衰老[M].北京：人民卫生出版社，2004：41-42.

[5] 刘忠静，郭艳奎，林梢航.外源过氧化氢对干旱胁迫下温室黄瓜叶绿体超微结构和抗氧化酶的影响[J].园艺学报，2009（8）：1140-1146.

[6] 福井谦一.化学反应与电子轨道[M].北京：科学出版社，1988：12-15.

[7] 李尔炀，蔡志强.生物化学[M].北京：化学工业出版社，2010：55-59.

[8] 罗纪盛.生物化学[M].上海：华东师范大学出版社，1997：10-13.

[9] 森谦治.生物活性物质化学：学习有机合成的思考方法[M].北京：化学工业出版社，2006：35-36.

[10] 赵宝路.氧自由基和天然抗氧化剂[M].北京：科学出版社，2005.

[11] 翟鹏，徐茂田，蒋芳婷.羟胺氧化反应活化能的测定[J].自然科学，2000（1/4）：166-169.

[12] KAMLESH S， EFROSINI K. PEGylated Liposomal doxorubicin targeted to α5β1-expressing MDA-MB-231 breast cancer cells[J]. Langmuir， 2012， 28（10）：4729-4736.

[13] 程霞.欧李多酚清除自由基活性研究[J].生态学报，2007（9）：15-17.

[14] 马建军，于凤鸣，杜彬张.欧李叶片过氧化物酶同工酶与叶果生理性状的相关性[J].经济林研究，2011（12）：20-23.