重度子痫前期患者外周血Th17和Treg细胞变化及意义

夏良萍，蔡琴，张晓凤(江苏大学附属第四人民医院检验科，江苏镇江212001)



重度子痫前期患者外周血Th17和Treg细胞变化及意义

夏良萍，蔡琴，张晓凤
(江苏大学附属第四人民医院检验科，江苏镇江212001)

摘要：目的探讨重度子痫前期（sPE）患者外周血Th17及CD4+CD25+Treg细胞变化及意义。方法选取2011-2013年镇江妇幼保健院40例sPE患者及40名健康对照者。采用流式细胞术检测外周血单个核细胞中Th17及CD4+CD25+Treg细胞水平；采用ELISA检测血浆IL-17、IL-22、TGF-β和IL-10水平，并分析其与sPE的相关性。结果sPE患者组外周血Th17细胞水平为(1.21±0.82)%，显著高于健康对照组的(0.74±0.63)%，差异有统计学意义(t=3.45，P=0.002)。sPE患者组外周血CD4+CD25+Treg细胞水平为(1.65±0.49)%，显著低于健康对照组的(2.42±0.91)%，差异有统计学意义（t=-4.25，P=0.001）。sPE患者组IL-17、IL-22水平分别为80.03±31.25、60.22±18.32ng/L，高于健康对照组的32.84±17.23、35.24±14.33ng/L，差异有统计学意义（t值分别为10.74、5.89，P均＜0.01），IL-10、TGF-β水平为26.29±10.31、25.65±11.81ng/L，低于健康对照组的33.24±11.93、48.261±13.85ng/L，差异有统计学意义(t值分别为3.35、6.78，P均＜0.01)。sPE患者血浆IL-17、IL-22水平与Th17细胞水平呈显著正相关(r=0.69、0.58，P＜0.01)。结论sPE患者Th17细胞数量增高，CD4+CD25+Treg细胞数量减少，以及相关细胞因子的紊乱在sPE的发病机制中可能起到重要作用。

关键词：重度子痫前期；T淋巴细胞；细胞因子类

重度子痫前期（server pre-eclampsia，sPE）是危害严重的妊娠期特有疾病，是导致孕产妇及围产儿患病和死亡的重要原因。Th17和调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）细胞是近年新发现的两个不同于Th1和Th2的Th细胞亚群。Th17主要分泌IL17、IL22等促炎症因子，在自身免疫中起重要的作用。Th17细胞在胚胎免疫排斥的发生中起一定作用[1]；而Treg细胞是一个可诱导免疫耐受并且有独特免疫调节功能的T细胞亚群，有助于母体对胎儿耐受[2]。本研究通过测定sPE患者外周血中Th17、CD4+CD25+Treg细胞水平及相关细胞因子表达，探讨其在sPE发病机制中的作用。

1　材料与方法

1.1研究对象选择2011年6月至2013年12月在镇江市妇幼保健院妇产科剖宫产分娩的sPE患者40例为研究对象，40例正常妊娠产妇为对照组。所有入组孕妇孕前均无高血压、肿瘤、内分泌等疾病，肝肾功能无异常。两组孕妇年龄、体重指数等比较，差异均无统计学意义(P>0．05)。sPE诊断标准参照乐杰主编的全国统编教材《妇产科学》第7版。

1.2标本采集采集sPE患者及正常产妇外周全血4ml，肝素抗凝。及时分离血清-70℃保存。

1.3试剂和仪器⑴Thl7流式检测试剂盒和CD4+CD25+Foxp3+Treg流式检测试剂盒购自Biolegend公司；佛波酯、离子霉素均购自Sigma公司；莫能霉素购自Biolegend公司；流式细胞仪型号为FACSCalibur（美国BD公司)。⑵细胞因子检测：ELISA试剂盒购自美国R&D公司；Bio-Rad imark酶标仪(美国Bio-Rad)。

1.4 Th17细胞的检测用Ficoll法分离出PBMC，用RPMll640重悬提取的PBMC；取20μl细胞悬液加20μl锥虫蓝，调节细胞浓度为2×106/ml；加入PMA和离子霉素后充分混匀，放入CO2细胞培养箱中培养1h后加入莫能霉素，混匀后培养5h。取培养后细胞悬液100μl于流式管中，每管加0.5ml固定液，摇匀室温孵育20min；加入2m l破膜洗液，混匀室温孵育20min后离心弃上清；用破膜洗液洗涤和重悬，加入10μl抗人IL-17Alexa Fluor647/ CD3 FITC/CD4 PE抗体混匀，室温孵育30min，30min内上流式细胞仪检测。

1.5 CD4+CD25+Treg细胞的检测取20μl细胞悬液加20μl锥虫蓝；加入1mlFOXP3透膜液，混匀后室温孵育20min；洗涤重悬细胞，室温孵育15min；加入10μl抗人FOXP3 Alexa Fluor488/CD25PE/ CD4 PerCP抗体后暗处孵育30min；30min内上流式细胞仪检测。

1.6外周血血浆IL-17、IL-22、IL-10、TGF-β检测采用酶联免疫吸附试验（ELISA），操作步骤按照ELISA试剂盒说明。

1.7统计学分析采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料以均值±标准差（±s）表示，定量资料比较采用两独立样本t检验，相关性分析采用Pearson相关分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 sPE患者外周血Th17细胞和CD4+CD25+Treg细胞水平sPE患者外周血Th17细胞水平为（1.21±0.82）%，高于健康对照组的（0.74±0.63）%，差异有统计学意义（t=3.45，P=0.002）；sPE患者外周血CD4+CD25+Treg细胞水平为（1.65±0.49）%，低于健康对照组的（2.42±0.91）%，差异有统计学意义（t=-4.25，P=0.001）。

2.2细胞因子检测结果sPE患者外周血IL-17、IL-22表达水平明显高于健康对照组，差异有统计学意义；sPE患者IL-10、TGF-β表达水平明显低于健康对照组，差异有统计学意义。见表1。

表1　重度子痫前期患者血浆中细胞因子的表达水平（n g/L，±s）

表1　重度子痫前期患者血浆中细胞因子的表达水平（n g/L，±s）

组别IL-17 （ng/L) IL-22 （ng/L) IL-10 （ng/L) TGF-β （ng/L)重度子痫前期组健康对照组t值P值例数4 0 40 80.03±31.25 32.84±17.23 10.74 <0.01 60.22±18.32 35.24±14.33 5.89 <0.01 26.29±10.31 33.24±11.93 3.35 <0.01 25.65±11.81 48.261±13.85 6.78 <0.01

2.3相关性分析sPE患者血浆IL-17、IL-22水平与Th17细胞水平呈显著正相关（r=0.69、0.58，P< 0.01）；IL-10、TGF-β与CD4+CD25+Treg细胞呈正相关（r=0.58、0.60，P<0.01）。

3　讨论

Th17细胞分泌高水平的IL-17、IL-22、IL-23，并高表达转录因子RORγt，Th17细胞在自身免疫性疾病中的研究证实其参与人体免疫及炎症反应的生物学过程[3，4]。Brewster等[5]研究表明，sPE患者血浆中IL-17水平显著高于正常妊娠组。有学者发现IL-17等Th17细胞系列细胞因子与胎膜早破、宫内感染等临床表现有密切关系[6]。本研究发现sPE患者外周血Th17细胞高于正常妊娠组，同时发现sPE患者外周血Th17细胞产生炎性因子IL-17、IL-22高于对照组。进一步证明Th17细胞在sPE发病机制中发挥一定的作用。Th17细胞分泌高水平的IL-17介导sPE的可能机制是：高水平IL-17与多种细胞因子协同作用，可促进胎盘小血管炎症反应。同时IL-17有募集中性粒细胞的能力，粒细胞释放的活性物质可造成内皮细胞损害，这可能是构成了患者血管痉挛、血压升高、蛋白尿、水肿等临床表现的病理基础。

Treg细胞是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，以表达转录抑制基因Foxp3为特征并分泌IL-10、TGF-β，可诱导免疫耐受并具有独特免疫调节功能的T细胞亚群[7，8]。近年来有研究证实sPE患者外周血中Treg细胞数量与正常妊娠组相比明显减少[9]。本研究发现sPE患者外周血Treg细胞低于正常妊娠组，与先前的报道相符。Treg细胞是维持人体自身免疫耐受的一组细胞群，Treg细胞活化后能抑制自身免疫反应性，能维持正常妊娠的免疫平衡，Treg细胞在胚胎着床及妊娠过程中起着至关重要的作用[10]。转录抑制基因Foxp3表达下降可能是影响Treg细胞增殖分化、细胞减少的因素之一，导致Treg细胞和效应性T、B淋巴细胞之间的失衡，最终引发病理妊娠。细胞因子TGF-β具有双向调节T淋巴细胞作用，低浓度的TGF-β可诱导RORγt表达水平升高，从而促进Th17细胞分化；而高浓度TGF-β能抑制IL-17的表达而增强Foxp3表达，进而促进Treg细胞增殖分化[11~13]。本研究发现sPE患者TGF-β水平明显降低，可能是TGF-β的降低导致Treg细胞减少，Th17细胞增加，使sPE患者免疫失衡，导致患者疾病的发生。

妊娠是全身各系统参与的过程，胎儿与母体间的免疫平衡决定了妊娠的成败，当免疫平衡失调，可导致病理性妊娠或妊娠失败[14]。随着新的CD4+T细胞的发现，现将传统的妊娠免疫理论模式发展为Th1/Th2/Treg/Th17模式[15]。研究Th17、Treg细胞在sPE发病机制中的作用为临床预测和治疗该疾病，寻找到治疗sPE等妊娠合并症的新靶点提供了一个新的思路。

参考文献

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·读者·作者·编者·

The imbalance of Th17 and Treg cells in patientsw ith severe pre-eclampsia

XIA Liangping，CAIQin，ZHANG Xiaofeng.Department of Clinical Laboratory，the Fourth Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China.

Abstract：Objective To analyze the levels of Th17 and CD4+CD25+Treg cells in peripheral blood of patientswith sPE.M ethods The percentage of Th17 and CD4+CD25+Treg cells in peripheral blood were examined by flow cytometry.Plasma cytokines levelsweremeasured by ELISA.Results The percentage of Th17 cells in patientswith sPE was higher than that of healthy controls[(1.21±0.82)%vs(0.74±0.63)%，t=3.447，P=0.002].The percentage of CD4+CD25+Treg cells in patientswith sPE was lower than that of healthy controls[(1.65±0.49)%vs(2.42±0.91)%，t=-4.25，P=0.001].Plasma levels of IL-17，IL-22 in sPE patients were 80.03±31.25、60.22±18.32ng/L，and in the control group were 32.84±17.23、35.24±14.33ng/L，respectively，they were significantly differentbetween the two groups(t=10.74、5.89，all P<0.01).However，IL-10 and TGF-βlevelsweremarkedly decreased in sPE patients compared with controls(26.29±10.31、25.65±11.81ng/L vs 33.24±11.93、48.261±13.85ng/L，t=-3.35、6.78，all P<0. 01).IL-17、IL-21 had positive correlation with Th17 cells(r=0.69、0.58，respectively，all P<0.01)in sPE patients.Conclusion This study suggests that the imbalance of Th17 cells and CD4+CD25+Treg cells，the disorder of related cytokines are important in the pathogenesis of sPE.

Key words：Severe pre-eclampsia；T-Lymphocytes；Cytokines

(收稿日期2015-11-03；修回日期2015-12-16)

作者简介：夏良萍，女，1977年3月出生，学士学位，检验主管技师，检验专业，主要研究方向：流式细胞术。

基金项目：江苏省卫生厅科研基金资助项目（H201249）

中图分类号：R446.62，R714.24+5

文献标识码：A

文章编号：1674-1129(2016)01-0018-03

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.006