ABCC4基因多态性与ITP患者糖皮质激素疗效的相关性分析

徐颜美，张静，李静，黄波，刘静，林晋，王燕，杨伟明，闵清华，王小中(、南昌大学第二附属医院检验科，江西南昌330006；、南昌大学第一附属医院检验科，江西南昌330006)



ABCC4基因多态性与ITP患者糖皮质激素疗效的相关性分析

徐颜美1，张静1，李静2，黄波1，刘静1，林晋1，王燕1，杨伟明1，闵清华1，王小中1
(1、南昌大学第二附属医院检验科，江西南昌330006；2、南昌大学第一附属医院检验科，江西南昌330006)

摘要：目的探讨ABCC4（ATP-binding cassette，subfamily Cmember 4）基因多态性rs10508022位点与ITP患者糖皮质激素疗效的相关性。方法收集我院2013年6月至2015年6月确诊的75例ITP住院患者作为病例组，其中46例糖皮质激素敏感型，29例糖皮质激素耐药型，并同期收集60例健康体检者作为对照组。采用SNaPshot法对所有受试者进行rs10508022位点基因分型，判断其与激素治疗ITP疗效的关系。结果rs10508022位点基因型频率分布在病例组与对照组间差异无统计学意义（P=0.15），但在ITP患者糖皮质激素敏感组和耐药组间差异有统计学意义（P=0.003），且G等位基因是ITP患者糖皮质激素耐药的风险等位基因（OR=3.17，95%CI=1.55-6.47）。结论ABCC4基因多态性与ITP患者糖皮质激素抵抗有关，且G等位基因可能是风险基因。

关键词：ABCC4；ITP；糖皮质激素

免疫性血小板减少症（Immune thrombocytopenia，ITP）是一种获得性自身免疫性疾病，血小板特异性自身抗体致敏的血小板被单核巨噬细胞系统破坏过度，且自身抗体抑制巨核细胞生成血小板，导致循环中血小板数量减少[1]。糖皮质激素是目前ITP治疗的一线药物，但由于个体间遗传背景不一致，仍有部分患者表现为糖皮质激素抵抗。因此，提前对ITP患者进行糖皮质激素敏感和抵抗评估，将有助于临床合理用药。虽然近年来糖皮质激素受体基因多态性（如BclI、N363S和ER22/23EK等）已被较好地研究[2]，但并未发现这些多态性与ITP患者激素治疗的相关性[3]。考虑到ABCC4基因编码的蛋白又称多重耐药相关蛋白4，本研究推测该基因多态性可能与糖皮质激素耐药机制有关，故采用SNaPshot法探讨其与ITP患者糖皮质激素疗效的相关性，为ITP治疗提供更明确的指导。

1　对象与方法

1.1研究对象根据《成人原发免疫性血小板减少症诊治的中国专家共识（修订版）》为ITP诊断标准[4]，收集2013年6月至2015年6月在南昌大学第二附属医院住院的75例成人ITP患者为病例组。收集同期60例健康体检者为对照组。本研究经南昌大学第二附属医院伦理委员会同意，所有受试者均签名同意参与此研究。

1.2方法

1.2.1糖皮质激素治疗及疗效判断本研究所纳入的ITP患者均以1～2mg/kg·d糖皮质激素为起始治疗，随后根据病情好转程度逐渐减量。糖皮质激素敏感和耐药的判断标准为：ITP患者经糖皮质激素治疗2周后，PLT≥30×109/L，比基础PLT至少增加2倍，且无出血表现为敏感型；PLT<30×109/L或增加不到基础PLT的2倍或有出血表现为耐药型[4]。

1.2.2基因组DNA提取及检测采集受试者外周EDTA抗凝静脉血3～4ml，根据血液基因组柱式提取试剂盒（德国Qiagen公司）说明步骤，提取基因组DNA，-20℃保存。采用Theromo NanoDrop 2000C紫外/可见分光光度定量仪器对DNA定量检测，以纯度OD260/280位于1.8～2.0为合格样本，用于后续SNaPshot检测。

1.2.3基因分型采用SNaPshot法对所有受试者DNA进行基因分型。SNaPshot技术原理是先扩增目标SNPs所在片段，用核酸外切酶和碱性磷酸酶消化体系中的引物序列和多余的单碱基，再以纯化后的扩增产物为模板，使用测序酶、标有不同荧光的ddNTPs和5’端紧靠SNP位点的延伸引物行PCR，最后采用基因测序仪对扩增产物检测不同的荧光信号，根据峰的移动位置来确定基因型。此步骤由武汉华大基因公司完成。

1.3统计学处理运用SPSS 17.0对一般临床资料进行统计学分析，组间比较采用单样本t检验。采用直接计数法计算SNP基因型和等位基因频率，以拟合优度χ2检验分析基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。应用χ2检验分析各基因型及等位基因频率分布差异，比值比（Odds ratio，OR）和95%置信区间（95%Confidence interval，CI）评价ABCC4基因多态性与ITP患者糖皮质激素疗效的关联强度。P<0.05为显著性差异标准。

2　结果

2.1临床特点根据一般临床资料统计分析，年龄在病例组与对照组间无显著性差异（P=0.72），PLT在两组间具有显著性差异（P=0.003）（见表1）。

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验病例组和对照组人群rs10508022位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P>0.05），表明本研究人群来自遗传平衡的群体，见表2。

表1　一般临床资料

表2　基因型频数分布的Hardy-Weinberg平衡检验

2.3 rs10508022位点基因型频率与ITP患者糖皮质激素疗效的关系rs10508022位点存在AA、AG 和GG三种基因型（见图1），病例组中基因型频率分别为76%、22.7%、1.3%，对照组中分别为88.3%、10.0%、1.7%，两组间无显著性差异（P= 0.15）（见表3）。

表3　rs10508022位点基因型频率在病例组与对照组间的分布

图1　SnaPsho t法检测rs10508022位点的3种基因型峰值信号图

rs10508022位点基因型频率在ITP患者糖皮质激素敏感组中分别为86.9%、10.9%、2.2%，耐药组中分别为58.6%、41.4%、0.0%，两组间具有显著性差异（P=0.00）（见表4）。

2.4 rs10508022位点等位基因型频率在糖皮质激素敏感组与耐药组间的分布rs10508022位点等位基因频率分布在ITP患者的糖皮质激素敏感组与耐药组间具有显著性差异（χ2=5.5，P=0.02）。敏感组的A等位基因频率为92.4%，显著高于耐药组（79.3%），提示A等位基因为糖皮质激素敏感的保护等位基因（OR=0.32，95%CI=0.16-0.64）。耐药组的G等位基因频率为20.7%，显著高于敏感组7.6%，提示G等位基因为糖皮质激素耐药的风险等位基因（OR=3.17，95%CI=1.55-6.47）（见表5）。

表4　rs10508022位点基因型频率在糖皮质激素敏感组与耐药组间的分布

3　讨论

糖皮质激素为ITP治疗的一线药物，由于个体遗传背景存在差异，部分患者表现为糖皮质激素抵抗，导致延误最佳治疗时机。虽然研究者对糖皮质激素受体基因多态性进行了较多的研究，但未发现其与ITP疗效的相关性。针对就ITP患者糖皮质激素治疗而言，目前仍然缺乏有效诊断指标对患者进行敏感和耐药评估。

ABCC4基因编码的蛋白又称多重耐药相关蛋白，是ABC转运蛋白家族成员之一，参与多种内源性和外源性物质运输[5]，主要介导胞内脂质跨膜转运[6]，如胆固醇外排，影响机体对药物的敏感性[7，8]。Andrew J等[9]发现巨核祖细胞中胆固醇流出会降低细胞表面促血小板生成素受体水平，抑制血小板产生。陈亚锋等[10]也报道高胆固醇血症患者的血小板膜表达CD40配体增加，最终促进炎症反应和血栓形成，提示胆固醇水平影响血小板的生成，其中ABCC4可能起着潜在重要的作用。此外，研究还报道ABCC4蛋白在肿瘤细胞中高表达，显著提高细胞化疗的耐药性，严重影响药物疗效，并与白血病等恶性肿瘤的预后及复发有关[11-15]。我们推测ABCC4基因异常改变蛋白功能活性，促进胆固醇外排，减少血小板生成，导致糖皮质激素治疗ITP患者时PLT升高不明显而出现的抵抗现象，但该基因与糖皮质激素之间的具体作用机制仍然不清，需要后续大量实验证实。

本研究结果显示ABCC4基因多态性rs10508022位点与ITP发病无显著关联（P=0.15），但在ITP患者糖皮质激素敏感组和耐药组间具有显著性差异（P=0.003），并且G等位基因是ITP患者糖皮质激素耐药的风险等位基因（OR=3.17，95% CI=1.58-6.34），提示该位点与ITP患者糖皮质激素抵抗具有显著相关性。这表明ABCC4基因多态性可作为ITP患者糖皮质激素疗效的预测指标之一，为ITP治疗提供更明确的指导。此外，由于ITP发病率低，大样本量检测仍然是ITP遗传学研究的巨大挑战，因此开展多中心合作研究收集更大样本量以丰富ITP遗传学分子机制显得尤为重要。

参考文献

[1]Kikuchi K，Miyakawa Y，Ikeda S，et al.Cost-effectiveness of adding rituximab to splenectomy and romiplostim for treating steroid-resistant idiopathic thrombocytopenic purpura in adults[J]. BMCHealth Serv Res，2015，15：2-9.

[2]Chihara M，Yoshihara K，Ishiguro T，et al.Association of NR3C1/ Glucocorticoid Receptor gene SNP with azoospermia in Japanese men[J].JObstet Gynaecol Res，2016，42(1)：59-66.

[3]Xuan M，Li H，Fu R，et al.Lack of association between NR3C1 polymorphism and glucocorticoid resistance in Chinese patients with immune thrombocytopenia[J].Platelets，2014，25(2)：125-128.

[4]侯明，秦平.成人原发免疫性血小板减少症诊治的中国专家共识（修订版）[J].中华血液学杂志，2012，32（9）：214-216.

[5]Huynh T，Norris M，Haber M，et al.ABCC4/MRP4：a MYCN-regulated transporter and potential therapeutic target in neuroblastoma [J].Front Oncol，2012，178(2)：1-7.

[6]Kielar D，Kaminski WE，Liebisch G，et al.Adenosine triphosphate binding cassette(ABC)transporters are expressed and regulated during terminal keratinocyte differentiation：a potential role for ABCA7 in epidermal lipid reorganization[J].J Invest Dermatol，2003，121(3)：465-744.

[7]陈霁晖，张健，林志燕，等.转运体ABCC4和ABCC5介导的肿瘤多药耐药研究进展[J].现代生物医学进展，2014，14（19）：3761-3765.

[8]Sun H，Wang X，Zhou X，et al.Multidrug Resistance-Associated Protein 4(MRP4/ABCC4)Controls Efflux Transport of Hesperetin Sulfates in Sulfotransferase 1A3-Overexpressing Human Embryonic Kidney 293 Cells[J].Drug Metab Dispos，2015，43(10)：1430-1440.

[9]Murphy AJ，Bijl N，Yvan-Charvet L，et al.Cholesterol efflux in megakaryocyte progenitors suppresses platelet production and thrombocytosis[J].NatMed，2013，19(5)：586-594.

[10]陈亚锋，刘昌慧，韩其蔚.高胆固醇血症患者血小板膜表达CD40配体[J].中国动脉硬化杂志.2004，12（2）：223-224.

[11]Copsel S，Bruzzone A，May M，et al.Multidrug resistance protein4/

ATP binding cassette transporter4：a new potentialtherapeutic target for acute myeloid leukemia[J].Oncotarget，2014，5(19)：9308-9321.

[12]Bruggemann M，Trautmann H，Hoelzer D，et al.Multidrug resistance associated protein 4(MRP4)gene polymorphisms and treatment response in adult acute lymphoblastic leukemia[J].Blood，2009，114(26)：5400-5401.

[13]Copsel S，Garcia C，Diez F，et al.Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4)regulates cAMP cellular levels and controls human leukemia cell proliferation and differentiation[J].J Biol Chem，2011，286(9)：6979-6988.

[14]李汝平，韩丽娟，张旭东，等.ABCC4/MRP4和ABCC5/MRP5基因在NK/T细胞淋巴瘤的表达及临床疗效的关系[J].中国癌症杂志，2014，24（1）：8-15.

[15]MontaniM，Herrmanns T，Müntener M，et al.Multidrug resistance protein 4(MRP4)expression in prostate cancer is associated with androgen signaling and decreaseswith tumor progression[J].Virchows Arch，2013，462(4)：437-443.

Association analysis of ABCC4 gene polymorphism with the therapeutic effect of glucocorticoid in ITP patients

XU Yanmei1，ZHANG Jing1，LI Jing2，HUANG Bo1，LIU Jing1，LIN Jin1，WANG Yan1，YANGWeiming1，MIN Qinghua1，WANG Xiaozhong1. 1.Department of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China.2.Departmentof Clinical laboratory，the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China.

Abstract：Objective To explore the association of ABCC4 rs10508022 gene single nucleotide polymorphism with glucocorticoid therapeutic effect in ITP patients.Methods Seventy-five hospitalized patients diagnosed with ITPwere collected from June 2013 to June 2015 in our hospital as case group，of which 46 patients were sensitive to glucocorticoid and remains were resistant to glucocorticoid.60 healthy subjects were collected from the same period as control group.The gene typing of rs10508022 was performed by SNaPshotmethod.And the correlation between rs10508022 and the effect of glucocorticoid therapy in ITP patients was estimated.Results The genotype distribution of rs10508022 had no statistical difference(P=0.15)between cases and controls，but had significant difference in the sensitive and resistantgroup for glucocorticoid in ITP patients(P=0.003).And Gallele was the risk allele for glucocorticoid resistance in ITP(OR=3.17，95%CI=1.55-6.47).Conclusions ABCC4 gene polymorphism is associated with the glucocorticoid resistant in ITP patients，and G allelemay be the risk allele.

Key words：ABCC4；ITP；Glucocorticoid

(收稿日期2015-11-24；修回日期2016-01-19)

通信作者：王小中，1973年12月生，教授，博士研究生导师，研究方向：血液病分子机制，E-mail：wangxzlj@126.com。

作者简介：徐颜美，1989年9月生，女，硕士，检验技师，研究方向：血液病遗传学发病机制；张静为共同第一作者，1990年4月生，女，硕士研究生，检验技师，研究方向：血液病遗传学发病机制。

基金项目：江西省教育厅项目（GJJ13157）

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.003

中图分类号：R446.62，R558.+2

文献标识码：A

文章编号：1674-1129(2016)01-0008-03