黄芪皂苷I对Th1免疫反应的调节效应及机制研究

顾瑛媛+宋娜丽+万春平

摘要：目的研究黄芪皂苷I的免疫调节作用以及作用的分子机理。方法构建丝裂原诱导脾淋巴细胞增殖细胞模型，测定黄芪皂苷I对ConA诱导T淋巴细胞增殖和LPS诱导B淋巴细胞增殖反应，构建anti-CD3 mAb抗体诱导T淋巴细胞增殖，RT-PCR检测黄芪皂苷I对IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA基因表达。结果黄芪皂苷I 在30nM显著促进ConA 刺激T淋巴细胞增殖，差异有显著性意义（P<0.05）；黄芪皂苷 I 体外用药能够显著上调IFN-γ，T-bet的mRNA表达，而对IL-2表达水平无明显影响。结论黄芪皂苷I可能特异性激活转录因子T-bet的转录，促进T 淋巴细胞增殖和细胞因子的产生。

关键词：黄芪皂苷I；T淋巴细胞；Th1免疫反应；IFN-γ；T-bet

中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）12-0072-03

【Abstract】Objective： To study the immunomodulatory effect of stragaloside I and its molecular mechanism. Methods： The splenic lymphocyte proliferation model induced by mitogen was established to determine the response of astragaloside I to T lymphocytes proliferation induced by ConA and B lymphocytes proliferation induced by LPS. T lymphocyte proliferation induced by anti-CD3 mAb antibody was established. RT-PCR was used to determine astragaloside I to the genetic expression of IL-2， IFN-γ and T-bet mRNA. Results： Astragaloside I significantly promoted the proliferation of T lymphocyte stimulated by ConA at 30 nM， and the difference was significant （P<0.05）. Astragaloside I administration in vitro significantly increased the mRNA expression of IFN-γ and T-bet， but had no significant effect on IL-2 expression. Conclusion： Astragaloside I may specifically activate the transcription of transcription factor T-bet and promote T lymphocyte proliferation and cytokine production

【Key words】Astragaloside I， T lymphocyte， Th1 immune response， IFN-γ， T-bet

扶正祛邪是中醫药防治疾病的特色，被广泛运用于各种疾病的治疗。中医认为“正气内存，邪不可干”“邪之所凑，其气必虚”。虚证指正气虚弱，现代研究表明虚证患者常表现为细胞免疫功能低下，体液免疫功能紊乱。可见，“正气”是机体免疫能力的一种中医表达方式。黄芪是我国经典传统补益中药，具有健脾补中、升阳举陷、益卫固表、利尿、托毒生肌之功效，《本草纲目》记载“可治一切气衰血虚之症”[1]。大量研究已证实，黄芪皂苷为黄芪主要活性成分[2-4]。黄芪甲苷能够促进小鼠T、B淋巴细胞增殖和抗体生成，显示出对细胞免疫和体液免疫较强的促进作用[5]。目前有关黄芪皂苷免疫调节活性研究主要集中在黄芪甲苷，其他皂苷组分研究较少，免疫调节作用机制尚未阐明。本论文旨在研究黄芪皂苷I的免疫调节作用，揭示其免疫调节的作用机理，为黄芪的临床应用和配伍提供实验依据。

1实验材料

1.1实验动物来源，种系，品系：BALB/c小鼠，7-8周龄，体重20-22 g，雌性，成都达硕生物科技有限公司提供，合格证号：SCXK（川）2008-24；动物饲养在SPF级动物房，实验动物至少饲养一周后使用。温度（22±1）℃，湿度（55±5）%，12 h光暗循环。饲料和水均在消毒后由动物自由摄取。所有实验均严格按照实验动物有关条例进行。

1.2主要药物与试剂黄芪皂苷I由云南中医学院左爱学博士提供，受试药物呈白色粉末状，纯度>99%，用DMSO作为溶剂配置成5 mg/mL储存液，-20℃保存备用，临用前用RPMI-1640培养液稀释成相应浓度；RPMI-1640培养基购自GibcoBRL公司（life Technologies，Grandisland，NY，USA）；胎牛血清（fetal bovine serum）购自Hyclone 公司（Logan，Utah，USA）；刀豆蛋白A（Concanavalin A，ConA）购自Sigma公司（St.Louis.MO，USA）；Trizol裂解液购置天根生化（北京）科技有限公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.3主要仪器离心机购自德国Thermo Scientific Heraeus；二氧化碳培养箱和生物安全柜均购自美国Thermo-fisher；Epoch连续波长酶标仪购自美国Bio-Tek公司。

2实验方法及评价

2.1脾淋巴细胞的制备小鼠脱脊椎处死，无菌取其脾脏。将脾脏用玻璃片磨碎，过膜，于1200 rpm离心5 min。弃去上清，沉淀加入红细胞裂解液（每个脾脏约1 mL），混匀，静置1分钟，加入PBS，离心。再加入PBS，过膜，离心。将所剩细胞洗涤1～2次后，用含10%FBS的RPMI-1640将细胞调至所需浓度。

2.2MTT法测定丝裂原诱导脾淋巴细胞增殖功能小鼠脾脏淋巴细胞（4×105个/孔）接种于96孔板，加入不同浓度的受试物，同时加入ConA（终浓度1μg/ml）或LPS（终浓度10μg/ml），另设无刺激剂的本底对照。于37℃，5% CO2培养箱中作用48h，MTT法检测丝裂原诱导脾淋巴细胞增殖功能。

2.3RT-PCR检测IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA基因表达因表达，用序列单环己基铵ed ymmunomodulatin-脾淋巴细胞（5×106个/孔）接种于anti-CD3 mAb抗体（5μg/ml）包被的24孔板中，加入黄芪皂苷II（30nM），另设相应溶媒对照和无刺激本底对照，于37℃，5% CO2培养箱培养16h后，收集细胞，Trizol一步抽提法提取总RNA，反转成cDNA，PCR检测检测IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA基因表达，电泳和成像。特异基因引物序列如下：

基因PCR引物序列IL-2：（sense）5-TGAGCAGGATGGAGAATTACAGG-3；（anti-sense）5-GTCCAAGTTCATCTTCTAGGCAC-3；IFN-γ：（sense）5-ATGAACGCTACACACTGCATC-3；（anti-sense）5-CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC-3；T-bet：（sense）5-CCAGGAAGTTTCATTTGGGAAGC-3；（anti-sense）5-ACGTGTTTAGAAGCACTG-3；β-actin：（sense）5-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3；（anti-sense）5-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3；2.3统计学分析所有实验数据均采用统计学方法处理。均值间差异比较采用t检验或单因素方差分析，数据统计均以平均值±标准差表示，以P<0.05为显著水平。数据统计分析采用SPSS17.0统计软件包。

3实验结果

3.1黄芪皂苷1对丝裂诱导脾淋巴细胞增殖反应的影响见图1。结果表明，1μg/mL Con A、10 μg/mL LPS顯著诱导T、B淋巴细胞发生克隆性增殖，黄芪皂苷I 在30nM显著促进ConA 刺激T淋巴细胞增殖，差异有显著性意义（P<0.05）。然而对LPS诱导的B淋巴细胞增殖无明显的影响（P>0.05）。

3.2黄芪皂苷I对IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA基因表达的影响见图2。RT-PCR方法检测黄芪皂苷 II对IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA表达情况。结果显示，anti-CD3 mAb刺激16h后能够显著诱导IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA表达，黄芪皂苷 I体外用药能够显著上调IFN-γ和T-bet的mRNA表达，而对IL-2表达水平无明显影响，说明黄芪皂苷I 在基因转录水平可能通过促进T-bet的转录而诱导IFN-γ的表达。

4讨论

在机体的细胞免疫中T细胞发挥着重要的作用，T淋巴细胞不仅是细胞免疫功能的承担者，而且也是免疫应答的调节者，其中以辅助性T淋巴细胞（Th）和抑制性T 淋巴细胞（Ts）对免疫网络的调节作用至为重要，参与多种自身免疫性疾病和肿瘤免疫过程。IFN-γ是Th1型细胞释放的重要的细胞因子，对Th1细胞的分化起着重要作用，同时其可诱导巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的产生，促进NO的合成，是IFN-γ抗肿瘤作用重要的分子机制之一[6-7]。IFN-γ能活化NK细胞，提高其对靶细胞的杀伤功能。

T 细胞激活后分化发展成为Th1、Th2、Th17和Treg等T淋巴细胞亚群受到不同转录因子的调节。T-bet属于T-box家族的转录因子，选择性表达于Th1细胞，作为Th1特异的转录因子能诱导Th1型细胞因子的产生，在Th1细胞的分化中起着决定作用[8]。T细胞激活后产生两种重要的细胞因子IL-2、IFN-γ，它们对促进和扩大免疫反应有很强的功能。IL-2是T细胞增殖所必需的T细胞生长因子，具有很强的免疫刺激作用和抗肿瘤活性[9]。我们的实验结果表明，黄芪皂苷I显著促进anti-CD3 mAb诱导的T淋巴细胞增殖。在mRNA水平上，黄芪皂苷 I 也能够显著上调 IFN-γ、T-bet 的mRNA表达水平。研究已证实，黄芪皂苷能够显著激活 CD45 PTPase 酶活性。在分子水平，黄芪皂苷能够显著促进CD45 PTPase作用底物P56LCK（Tyr505）去磷酸化。基于以上实验结果，推测黄芪皂苷 I作为CD45 PTPase激活剂，在细胞水平可能通过激活CD45 PTPase，参与TCR介导的T淋巴细胞信号转导，从而激活下游相关信号通路，引起Th1特异性转录因子T-bet转录激活，促进T 淋巴细胞增殖和IL-2、IFN-γ的产生。该研究丰富和发展黄芪“健脾补中，益卫固表”功效的科学内涵，为传统中药的现代研究提供新的研究思路和方法。

参考文献：

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[2]Chun-Ping Wan，Li-Xin Gao，Li-Fei Hou，et al.Astragaloside triggers T cell activation through regulating the activity of CD45 protein tyrosine phosphatase[J].Acta Pharmacologica Sinica，2013，（34）：522-530.

[3]万春平.黄芪皂苷类组分生物活性研究进展[J].云南中医中药杂志.2011，32（8）：79-81.

[4]万春平.黄芪皂苷III通过IFN-γ介导体外免疫调节作用的研究[J].云南中医中药杂志.2011，32（9）：69-71.

[5]Wang YP，Li XY，Song CQ，et al.Effect of astragaloside IV on T，B Lymphpcyteproliferation and peritoneal macrophage function in mice[J].Acta Pharmacol Sin.2002，（3），263-266.

[6]Susanne J.Szabo，Brandon M.Sullivan，Stanford L.PengAnnu.Rev.molecul ar mechansism regulating Th1 immune responses.Immunol.2003，21：713-58.

[7]金伯泉.细胞和分子生物学[M].北京：科学出版社，2001：185-186.

[8]Ansel KM，Lee DU，Rao A.An epigenetic View of helper T cell differation[J].Nat Immunol.2003，（4）：616-23.

[9]Tomas Mustelin，Souad Rahmouni，Nunzio Bottini.et al.Role of protein tyro sine phosphatases in T cell activation[J].Immunological Reviews，2003，（191）：13 9-147.

（收稿日期：2017-11-10）