急性低血糖大鼠血清GLP-1蛋白及下丘脑组织GLP-1R蛋白、mRNA表达变化

屈丹，姜雅秋

(1中国医科大学附属第一医院，沈阳 110001；2本溪市中心医院)



急性低血糖大鼠血清GLP-1蛋白及下丘脑组织GLP-1R蛋白、mRNA表达变化

屈丹1,2，姜雅秋1

(1中国医科大学附属第一医院，沈阳 110001；2本溪市中心医院)

摘要：目的观察急性低血糖大鼠血清胰高血糖素样肽1(GLP-1)蛋白及下丘脑组织GLP-1受体(GLP-1R)蛋白、mRNA表达变化。方法 Wistar雄性大鼠21只，其中14只大鼠腹腔注射短效胰岛素诱导急性低血糖，血糖在2.00～2.64 mmol/L者计为A组(7只)，血糖<2.0 mmol/L者计为B组(7只)；另7只大鼠(C组)不采用任何干预措施，血糖维持在正常水平。采用ELISA法检测各组血清GLP-1，Western blotting法和实时荧光定量PCR法分别检测下丘脑组织GLP-1R蛋白、mRNA。结果与B组比较，A组下丘脑组织GLP-1R mRNA表达降低；与C组比较，A组血清GLP-1、下丘脑组织GLP-1R mRNA及B组血清GLP-1表达降低，A组下丘脑组织GLP-1R蛋白及B组下丘脑组织GLP-1R蛋白、mRNA表达升高；P均<0.05。结论 急性低血糖大鼠血清GLP-1蛋白表达降低，下丘脑组织GLP-1R蛋白表达升高，轻度低血糖时GLP-1R mRNA相对表达量下降、重度时升高。

关键词：低血糖；胰高血糖素样肽1；胰高血糖素样肽1受体；动物实验

机体在应激时会为生存做出必须的生物调整来维持体内平衡[1]，包括刺激脑中通路引起下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴和交感神经系统(SNS)轴的激活，从而导致一系列神经内分泌反应。室旁核的促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)神经元是启动HPA轴反应的重要构成。研究[2]发现，CRH神经元的分泌活动直接接受胰高血糖素样肽1(GLP-1)的调控，中枢GLP-1能调节HPA轴的应激反应[3～5]。急性低血糖是一种急性应激状态，在低血糖发生时下丘脑的“糖感受器”将信息迅速传递到相关神经元，引起下丘脑CRH细胞兴奋，CRH神经元的分泌活动直接接受GLP-1的调控，GLP-1受体(GLP-1R)同时在下丘脑表达。2013年9月～2015年3月，我们观察了急性低血糖大鼠血清GLP-1蛋白及下丘脑组织GLP-1R蛋白、mRNA表达变化，旨在探讨急性低血糖应激时中枢神经系统GLP-1R是否参与应激调节。

1材料与方法

1.1实验动物与试剂SPF级Wistar雄性大鼠21只，3～8周龄，体质量200～220 g，购自北京维通利华实验动物中心。大鼠GLP-1 ELISA试剂盒购自美国R&D公司(货号CK-E 30402R)，TRIzol、逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、GLP-1R及β-actin引物购自大连宝生物公司，GLP-1R一抗购自北京博奥森生物有限公司。

1.2实验动物分组及短效胰岛素干预21只大鼠分为A、B、C组各7只，A、B组参照文献[6]方法腹腔注射短效胰岛素(生物合成人胰岛素，50 U/kg)。以微型血糖仪测量血糖，并记录所有大鼠腹腔注射胰岛素后每隔30 min的血糖值，直至达到目标血糖。A组大鼠血糖2.00～2.64 mmol/L，大鼠兴奋，身体发抖，四处觅食；B组大鼠血糖<2.0 mmol/L，大鼠神志恍惚，甚至全身抽搐。C组大鼠不采用任何干预措施，血糖维持在正常水平[7]。大鼠称体质量，10%水合氯醛腹腔麻醉，上腹正中切口，游离肋骨，心脏采血，3 000 r/min离心 10 min，分离血清，存入Eppendorf管中，-80 ℃冰箱中保存。大鼠经心脏采血后断头，3 min内取脑，分离脑组织后迅速置于-40 ℃干冰异戊烷中，30 s快速冷冻脑组织，后于-80 ℃冰箱冻存。

1.3大鼠血清GLP-1蛋白检测采用ELISA法检测，操作按照试剂盒说明书进行。

1.4大鼠下丘脑组织GLP-1R蛋白检测采用Western blotting法。组织裂解液裂解下丘脑组织，12 000 r/min离心5 min，取上清，测定总蛋白。已溶解于加样缓冲液的总蛋白质经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，100 V电泳转移至硝酸纤维膜上，脱脂奶粉封闭液封闭2 h，用1∶100稀释GLP-1R抗体(兔抗鼠多克隆抗体)进行Western 蛋白印迹杂交，40 ℃孵育过夜。1∶400稀释的二抗孵育2 h，采用DAB显色试剂盒显影并检测，获得蛋白相对表达定量。GLP-1R蛋白表达以GLP-1R/β-actin灰度值比率来计算。

1.5大鼠下丘脑组织GLP-1R mRNA检测采用实时荧光定量PCR法。取下丘脑组织50～100 mg，提取总RNA，并进行逆转录反应得到cDNA，再进行实时荧光定量PCR反应。GLP-1R：5′-CAT CGC TTC AGC CAT CCT TG-3′，5′-CAG CCG TGC TAT ACA TCC ACT TG-3′，162 bp；GAPDH: 5′-TGG TGA AGG TCG GTG TGA AC-3′，5′-CCA TGT AGT TGA GGT CAA TGA AGG-3′，123 bp；反应体系25 μL，逆转录反应条件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s；PCR反应条件：95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环40次；PCR反应结束后，分析DNA扩增曲线，使用专用数据处理软件获取数据，以2-ΔΔCT代表目的基因mRNA的相对表达量。

2结果

各组大鼠血清GLP-1蛋白及下丘脑组织GLP-1R蛋白、mRNA表达比较见表1。

表1　各组大鼠血清GLP-1蛋白及下丘脑组织GLP-1R蛋白、mRNA表达比较

注：与B组比较，*P<0.05；与C组比较，△P<0.05。

3讨论

GLP-1属于胃肠激素，主要由末端空肠、回肠、结肠的L细胞分泌，是胰高血糖素原(PPG)基因翻译表达的产物。葡萄糖、脂肪等营养物质均能直接刺激GLP-1的释放。GLP-1与其受体特异性结合后，发挥抑制胰高糖素分泌、促进胰岛细胞增殖、抑制胃排空、抑制胃酸分泌等多种生物学作用[8～11]。也有研究[12]表明，GLP-1在调节摄食和体质量方面发挥重要作用，如抑制水的摄入、维持血糖水平、调节心率和血压以及调节HPA轴的应激反应[3～5]。尽管血液循环中GLP-1不易通过血脑屏障，但这些影响可能通过中枢神经系统的GLP-1神经元来调节。

GLP-1R分布广泛，除胰腺和胃肠道外，还分布于肺、肾脏和心脏等全身多个组织和器官，在周围神经系统与中枢神经系统表达丰富[13,14]。Northern杂交试验表明，GLP-1R在胰岛、肺和心脏中的表达量较其他组织高。从胰岛、心脏和大脑克隆得到的cDNA片段编译的氨基酸序列相同，且与GLP-1的亲和力相同，表明GLP-1R在中枢神经系统和心血管系统均具有一定的生物学功能。另外研究[15]发现，GLP-1R的表达在不同部位受不同因素的影响。

急性应激导致中枢GLP-1、PPG mRNA明显下调。慢性应激也导致孤束核PPG mRNA和室旁核GLP-1免疫反应性下调。PPG mRNA下调可以被糖皮质激素长短反馈调节，这也许是限制应激导致的HPA轴工作过度的一种适应机制[16]。GLP-1减少与应激中止后1～2 h生理不应期相一致，阻止了HPA轴过度激活和潜在的有害后果，同样长期下调可能限制GLP-1神经元重复激活的影响，可能也是应激的一个重要适应机制。本研究显示，A、B组血清GLP-1蛋白表达低于C组，可见急性低血糖应激与其他应激反应相同，此时血清GLP-1也是减少。A、B组下丘脑组织GLP-1R蛋白表达升高，分析其原因考虑为GLP-1需与GLP-1R特异性结合才能发挥其生物学作用，大鼠下丘脑组织GLP-1R蛋白表达虽然升高，但急性应激时GLP-1生物利用度减少导致GLP-1激动减少，这种变化也有助于应激时HPA轴恢复。本研究还显示，与C组比较，A组下丘脑组织GLP-1R mRNA表达降低，B组下丘脑组织GLP-1R mRNA表达升高，这种变化也与应激中止后1~2 h生理不应期相一致，阻止了HPA轴过度激活和潜在的有害后果。

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(收稿日期:2015-09-23)

中图分类号：R363.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)03-0028-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.010

通信作者：姜雅秋(E-mail： jiangyaqiu@yeah.net)

基金项目：辽宁省重大疾病动物实验研究及临床应用项目(2012225021)。