卵巢癌患者腹水及外周血CD4+ CD25+调节性T细胞含量及抑制功能的研究

孙洁 杨素芬 白图门 李梅 董迅 陈小萍

【摘要】目的：分析并探讨卵巢癌患者腹水及外周血CD4+CD25+调节性T细胞含量及抑制功能。方法：选取2012年2月至2015年2月期间在我院和宁波市鄞州第二医院接受治疗的卵巢癌患者56例，采集腹水标本56例，外周血标本56例。使用流式细胞术检测CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）的表达。采用15μmol/L的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）标记CD4+CD25- T细胞，观察CFSE标记效果，计算抑制率。结果：研究结果显示，56例腹水患者CD4+CD25+ T cells/CD4+T cell为（2834±1327）%，56例外周血标本CD4+CD25+ T cells/CD4+ T cell为（1456±436）%。腹水和外周血标本CD4+CD25+ T cells/CD4+ T cell含量有显著差异（P<005）。腹水Treg抑制功能比外周血Treg强，经统计学检验，差异具有统计学意义（P<005）。结论：腹水Treg含量及抑制功能比外周血Treg强，提示卵巢癌腹腔内相对容易发生免疫逃逸，而Treg升高可能参与促进肿瘤复发。

【关键词】卵巢癌；腹水；外周血；CD4+CD25+调节性T细胞

【中图分类号】R73731【文献标志码】A

卵巢癌是一种女性常见妇科恶性肿瘤，是女性致死率最高的肿瘤类型，已严重威胁其患者的生命健康[1]。临床中未见肿瘤初期的敏感诊断方式，这将导致一经确诊基本为中晚期，延误最佳治疗时机[2]。近年来，针对卵巢癌的免疫学机制研究逐渐成为热点，对肿瘤微环境的免疫学机制变化深入了解，有助于提高未来卵巢癌早期诊断及后期治疗的成功率[3]。在本次研究中，选取卵巢癌患者56例，分析并探讨卵巢癌患者腹水及外周血CD4+CD25+调节性T细胞含量及抑制功能。

1资料与方法

11一般资料

选取2012年2月至2015年5月期间在我院和宁波市鄞州第二医院接受治疗的卵巢癌患者56例，采集腹水标本56例，外周血标本56例。纳入标准：（1）经病理检查和细胞学检查均被确诊为卵巢癌；（2）签署知情同意。排除标准：（1）感染性疾病患者；（2）非自愿参加者。该研究得到伦理学会的批准，且在采集标本前得到了患者的许可，允许进行后续实验。

12实验方法

在卵巢癌患者腹腔穿刺术后采集腹水标本，并使用无菌的引流袋将其安置于冰中保存用于后续实验分析。外周血标本则在清晨空腹后采集静脉血获得，加入EDTA抗凝处理[4]。

使用流式细胞术检测CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）的表达[5]。使用CD4+Multisort kit获得CD4+ T细胞，然后使用CD25的磁珠阳性分选得到CD4+CD25+ T细胞和CD4+CD25- T细胞。经检测，CD4+CD25+ T细胞浓度在90%以上。

分选得到CD4+CD25+ T细胞和CD4+CD25- T细胞，采用15μmol/L的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）标记CD4+CD25- T细胞，观察CFSE标记效果[6]。CD4+CD25+ T细胞和CFSE标记的CD4+CD25- T细胞按0：1、1：1、1：2及1：4比例在10%的胎牛血清-RPMI-1640培养体系内进行共培养，加入人淋巴细胞CD3单克隆抗体、人淋巴细胞CD28单克隆抗体以及人重组IL-2作为激活因子。5d后使用流式细胞仪检测CFSE表达，计算抑制率。

13统计学分析

对观测结果使用统计学软件SPSS 190分析，计量资料采取t检验，率的比较采取卡方检验，以P<005为差异有统计学意义的判断标准。

2结果

21卵巢癌腹水及外周血中CD4+CD25+ T细胞的检测结果分析研究结果显示，56例腹水患者CD4+CD25+ T cells/CD4+ T cell为（2834±1327）%，56例外周血标本CD4+CD25+ T cells/CD4+ T cell为（1456±436）%。腹水和外周血标本CD4+CD25+ T cells/CD4+ T cell含量有显著差异，经统计学检验，差异具有统计学意义（P<005）。

22卵巢癌腹水及外周血CD4+CD25+免疫抑制功能测定结果分析腹水Treg抑制功能比外周血Treg强，经统计学检验，差异具有统计学意义（P<005）。见表1。表1卵巢癌腹水及外周血CD4+CD25+免疫抑制功能测定样本例数

（例）S/R（%）1：11：21：4腹水567437±14337053±13334454±1253血液565849±5635101±4562841±444t547711614P<005<005<005

3讨论

随着近年来肿瘤研究逐渐深入，许多文献证实部分肿瘤抗原与自身抗原相似甚至相同，免疫细胞对外来抗原发挥识别、清除功能，但因部分肿瘤抗原与自身抗原相同，未成功识别，从而使肿瘤继续生长蔓延[7]。研究表明，CD4+CD25+调节性T细胞具有抑制自身T细胞表达及识别的能力，可以进一步帮助肿瘤细胞在免疫系统监控下逃脱[8]。基于上述理论，近年来针对CD4+CD25+调节性T细胞与肿瘤免疫微环境的关系研究逐渐增多，对肿瘤微环境的免疫学机制变化深入了解，有助于提高未来卵巢癌早期诊断及后期治疗的成功率。

有研究证实，在肝癌、乳腺癌及结肠癌患者血清中发现CD4+CD25+调节性T细胞数量有所增多，且在肿瘤病灶处结果亦然[9]。随后，有人报道发现在卵巢癌患者中发现CD4+CD25+调节性T细胞也有所增加，并且随着癌症的发展，增加的愈发明显。增加的越明显，该疾病的预后表现越差[10]。肿瘤病灶甚至全血内存在一定免疫抑制，这种抑制可能是通过CD4+CD25+调节性T细胞介导的，同时有报道证实，这种介导并非由活化T细胞刺激而来[11]。动物实验表明，通过体外注射抑制CD4+CD25+调节性T细胞活性药物，可有效减轻小鼠体内免疫抑制情况[12]。针对上述现象，目前主要有两种可能假设：肿瘤发生后，刺激CD4+CD25+调节性T细胞增殖，继而引起免疫抑制；肿瘤表面抗原使CD4+CD25+调节性T细胞发生常规增殖[13]。

为了进一步分析并探讨卵巢癌患者腹水及外周血CD4+CD25+调节性T细胞含量及抑制功能，进行本次调查研究，结果发现，56例腹水患者CD4+CD25+ T cells/CD4+ T cell为（2834±1327）%，56例外周血标本CD4+CD25+ T cells/CD4+ T cell为（1456±436）%。腹水和外周血标本CD4+CD25+ T cells/CD4+ T cell指数有显著差异，经统计学检验，差异具有统计学意义（P<005）。有报道指出，CD4+CD25+调节性T细胞并不能用来研究其抑制功能，但因腹腔转移是卵巢癌患者主要转移途径，且部分研究报道中确实提出腹水内该调节性T细胞能在一定程度上预测疾病进展[14]。同时，本次研究中显示腹水Treg抑制功能比外周血Treg强，经统计学检验，差异具有统计学意义（P<005）。这可能说明CD4+CD25+调节性T细胞对肿瘤趋化、募集有一定作用，通过作用于趋化因子等诱导细胞迁移[15]。

综上所述，腹水Treg含量及抑制功能比外周血Treg强，提示卵巢癌腹腔内相对容易发生免疫逃逸，而Treg升高可能参与促进肿瘤复发。

参考文献

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