犬肥大细胞瘤诊断方法研究进展

李格宾，杨紫嫣，夏兆飞

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)



犬肥大细胞瘤诊断方法研究进展

李格宾△，杨紫嫣△，夏兆飞*

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

肥大细胞瘤是犬最常见的皮肤肿瘤，其恶性率和转移率都较高，因此，探寻诊断、治疗犬肥大细胞瘤的新型有效方法就显得十分必要。论文详细介绍了两种诊断犬肥大细胞瘤的病理学分级体系,即Patnaik分级体系与Kiupel分级体系，同时解释了c-kit基因的生理作用及诊断价值，介绍了国外常用的犬肥大细胞瘤c-kit基因突变诊断方法，重点阐述了c-kit基因突变与犬肥大细胞瘤诊断、病理学分级、治疗方案的确定及预后的关系，以期能对我国小动物临床的医生和科研工作者有所启发。

犬;肥大细胞瘤；诊断方法

肥大细胞瘤(mast cell tumor，MCT)是犬发生率最高的皮肤肿瘤，占所有皮肤肿瘤的16%～21%，其恶性率达19%～39%，其高发年龄为7岁以上[1]。低分化的MCT(high grade)转移率在55%～96%，一般最先转移至淋巴结，随后转移至脾脏和肝脏，最后转移至骨髓，此时在外周血液中会发现大量肥大细胞，称为肥大细胞血症。MCT中大量肥大细胞向血液中释放的组胺、肝素及其他血管活性物质会导致患犬出现一系列临床症状，例如过量组胺导致十二指肠溃疡，机械刺激肿瘤导致肿瘤周围出现浮肿和红斑，严重时还会导致患犬发生低血压或呕吐等急性全身症状，如过敏性休克，大多数患犬在发现肿瘤后1年内死亡[2-3]，因此患有恶性MCT的犬无论是生存期还是生存质量都不尽如人意。对于局部单发且无远端转移的MCT患犬，一般会采用手术结合放疗的治疗方法，但是由于昂贵的放疗设备和治疗费，该治疗方法目前不能被广大动物医院和宠物主人所接受。而对于患有远端转移或侵袭性很强的MCT患犬来说，则需采取化学疗法。传统化疗药物的主要作用机制是利用肿瘤细胞比正常细胞生长活跃的特点，通过阻断肿瘤细胞DNA的合成周期来起作用，所以在杀死肿瘤细胞的同时也会损伤其他分裂速度快的细胞(如骨髓中的造血干细胞和胃肠道上皮细胞)，引发各种副作用如骨髓抑制和胃肠道功能紊乱等。近些年，多项研究和临床病例报告均报道了分子靶点药物对犬MCT的疗效，这一新型治疗方法引起了人们的广泛关注，但是分子靶点药物并非对所有MCT均有效，其仅对发生了c-kit基因突变的MCT治疗有效，因此分子学诊断方法可以大幅度提高分子靶点药物治疗犬MCT的有效率。如今，我国的小动物临床也逐渐开始建立MCT分子学诊断方法，下面对犬MCT诊断方法的相关研究进展做一概述。

1 组织病理学诊断

1.1 Patnaik病理学分级体系

该分级体系是在1984年由Patnaik A K等[4]通过对83例手术切除的MCT进行病理学分级，并且在随后3年跟踪调查该83只犬的生存时间所得出的。在该系统中，Ⅰ级 MCT 的肥大细胞分化良好；在真皮胶原纤维中呈整齐散在排列；胞浆空间充裕，充满颗粒；核染色质浓缩；无明显的核仁和有丝分裂细胞。Ⅱ级 MCT 的肥大细胞分化良好；胞浆空间充裕，充满颗粒；轻度的细胞异型性；一些多孔的细胞核核仁明显，核仁有的呈疱状；有丝分裂的细胞数量适中。Ⅲ级MCT的肥大细胞细胞质模糊；中度至重度异型性；细胞核深染，核仁明显；可见有丝分裂细胞。

随后的生存率调查发现，在1500d内Ⅰ级 MCT 患犬的存活率是Ⅱ级的16倍，Ⅱ级 MCT患犬的存活率是Ⅲ级的5倍[4]；另有研究报道，Ⅰ 级 MCT的转移率低于10%，Ⅱ级为5%～22%，Ⅲ级为80%[5]。由此可见，MCT的病理学分级越高，患犬存活时间越短，肿瘤转移率越高。

1.2 Kiupel病理学分级体系

由于不同病理学家使用 Patnaik 分级体系界定MCT分级的条件并不十分一致，有时会造成对MCT病理学分级的混乱。为了增强对MCT病理学分级的一致性，Kiupel M等[6]28位组织病理学专家对95例MCT样品进行双盲试验。他们认为在Ⅰ级与Ⅱ级之间缺乏显著的界定条件，并且综合Ⅰ级与Ⅱ级MCT患犬的存活率数值，他们认为应将Ⅰ级与Ⅱ级统一合并为低等级。随后该分类法被命名为Kiupel病理学分级体系，并将MCT组织分为高等级和低等级两级。高等级必须同时满足如下条件：在10个高倍视野(high-power field，HPF)内至少可见7个细胞有丝分裂相；在10个HPF中至少可见3个多核细胞(3个细胞核以上)；在10个HPF中至少可见3个异常的细胞核；并有巨核细胞出现。

随后使用Kiupel 病理学分级体系显示,高等级的MCT患犬具有更高的病死率和肿瘤转移率，并且患犬存活时间和肿瘤转移所需时间都更短[6]。根据Sabattini S等人(2015)对137例犬MCT组织病理学研究表明,Kiupel分级法对诊断犬皮肤MCT更有诊断价值，并且他们认为仅用组织病理分级这一种诊断方法并不能将疾病的预后把握完全，还需辅助以分子诊断方法，这样才能获得更加精确、完整的诊断结果[7]。同时，Scarpa F等[8]认为细胞学检查结果也可作为肿瘤分级的参考标准之一，可以为随后进行的手术或其他治疗方案提供更多的信息，该研究结果显示了细胞学与组织学之间具有强烈的相关性，但对于一些高分级的MCT仍存在细胞学与组织学结果不一致的情况。

组织病理学是诊断MCT的金标准，其分级体系对MCT治疗方案的确定和预后都起着至关重要的作用。Patnaik病理学分级体系目前广泛用于欧美等发达国家，而国外对Kiupel分级体系的认可度较有限，其常作为Patnaik分级体系的辅助指标。随着国内小动物临床诊疗技术的发展，建立规范的病理分级制度是非常有必要的，它可为MCT患犬提供精确的诊断，为进一步治疗打下坚实基础。

2 c-kit基因突变诊断

2.1 c-kit基因及KIT蛋白

c-kit 基因编码 Ⅲ 型酪氨酸激酶跨膜受体(KIT)，它的配体是干细胞因子(stem cell factor，SCF)。这种受体蛋白在结构上主要包括3个部分：①5个膜外免疫球蛋白样区域，由外显子(exon)1～9编码；②跨膜区，由exon10编码；③膜内区，由exon11～21编码。膜内区又可以分为负调控因子近膜区与细胞质酪氨酸激酶区，负调控因子近膜区由exon11和12编码，细胞质酪氨酸激酶区又被分解为 ATP 结合区(exon13)和转磷酸酶小环区(exon17)[9]。像其他酪氨酸受体那样，只有捆绑配体(SCF)才能导致受体(KIT)二聚化，随后激活酪氨酸激酶，最终使细胞启动自动磷酸化与外源性基质的磷酸化，这些磷酸化作用将会引起下游信号转导，激活细胞内信号通路如：Shc/Ras/MAOK,JAK/STAT 和 PI3K 级联反应[9-10]。c-kit 受体信号在红细胞生成、淋巴细胞生成、肥大细胞的成熟和功能完善、巨核细胞生成、配子生成、黑色素生成中具有重要作用[11]。c-kit基因主要在浦肯野氏纤维和星形胶质细胞中表达，而对于起源于造血干细胞的细胞来说，肥大细胞是唯一过度表达这种蛋白的细胞类型，正常情况下，肥大细胞的生长、成熟、增殖大部分由KIT 蛋白所调控；另外，c-kit 基因在哺乳动物中是高度保守的，比如犬与人类和小鼠的c-kit 基因相似度分别为88%和82%[12]。

2.2 c-kit 基因突变

随着分子学研究方法逐渐应用于小动物临床，欧美及日本等国家研究发现，有将近15%～40%的犬MCT包含c-kit基因突变，目前发现的突变包括点突变、内部序列重复突变(internal tandem duplication，ITD)和碱基缺失突变[9,13]。在诸多犬MCT的病例中，已经确认的突变位点有c-kit表达的膜外区(exon8和exon9)、近膜区(exon11)和转磷酸酶小环区(exon17)。这些突变(c-kit激活性突变)导致 KIT 蛋白无需依赖配体(SCF)，自身即可持续磷酸化[9]。KIT蛋白异常磷酸化会导致下游信号不受控制，最终引起细胞增殖与凋亡周期失控，已有大量文献证实 c-kit突变与犬MCT的发生、发展有显著关系[14]。

已发现的犬突变位点中exon11的突变率最高，占突变总数的14%～21%[15]，另有文献认为高达64%[9]；exon8突变率约为4.7%，exon9突变率约为4.2%，其他exon的突变均小于3%[15]。在exon8、9、11的突变中，exon8大部分为ITD突变，极少数为点突变；exon9全部为点突变；exon11大部分为ITD突变(占突变总数9%～17%[15])，极少数为点突变和碱基缺失突变；exon17全部为碱基缺失突变[9]。

2.3 c-kit 基因突变检测方法

国外小动物临床c-kit基因突变检测通常采取的方法是：对临床收集的MCT组织细胞提取基因组DNA，随后进行PCR扩增，将样品PCR产物与野生未突变和已知突变的基因组作对比，最后判定是否产生突变及突变位点[12,16]。由于exon11突变率较高，国外文献中关于未突变exon11基因大小的叙述较一致(190bp)，若exon11发生ITD突变，且突变条带大小约为250bp，那么在电泳结果中可见2个条带[17]。

在欧美及日本小动物临床MCT的诊疗中，分子学诊断方法因操作简单、快速、成本低廉，并且可为临床用药提供依据，c-kit基因突变检测已成为所有MCT病例常规检查的一部分，但我国尚未开展此项检查。本文通过对国外最新c-kit突变基因的相关研究的总结，以期为国内小动物临床提供新的视野。

3 c-kit 基因突变与病理学分级的关系

早在2002年，Zemke D等[18]研究就已经发现c-kit基因突变，特别是近膜区(exon11)ITD突变与 MCT 病理分级Ⅲ级呈显著相关性。随后Downing S等[19]的研究认为发生c-kit基因ITD突变的MCT与其恶性程度呈现紧密相关性。统计表明c-kit基因突变在Ⅱ级、Ⅲ级MCT中的发生率较相似，并且会导致更高的原位复发率和转移率。Passantino L等[20]运用免疫组化的方法发现，发生c-kit突变的肥大细胞越多，由其组成的MCT所表现出的侵害性越强。Schlieben P等[21]的研究发现,唯有exon11ITD突变与Kiupel病理分级系统中高等级的相关性很显著。随后，Takeuchi Y等[13]研究也证实了这一点，同时他们还证实了Zemke D等研究结果,exon11ITD 突变与Patnaik分级系统中的Ⅲ级MCT呈现一定的相关性。而c-kit基因其他突变位点的病例相对较少，其与MCT病理学分级的关系尚未得到证实。

4 c-kit 基因突变与存活率及存活时间的关系

Webster J D等[22]研究表明，存在exon11ITD 突变的患犬，其生存期与肿瘤复发间隔时间明显缩短；与肿瘤相关的死亡率、原位复发率和其他位置转移率明显上升。为了进一步确定c-kit 基因突变与存活率的关系，Takeuchi Y等研究发现,除了exon11的ITD 突变与肿瘤无进展存活期(progression free survival，PFS)呈显著相关性，其他c-kit 基因突变位点与存活期并无显著相关性。

5 小结

由于犬MCT的发生率、恶性率和转移率都较高，因此对于恶性MCT的患犬，目前的传统治疗方法很难达到理想的效果，而过于激进的治疗方法也会导致患犬生活质量严重下降，虽然肿瘤多肽疫苗是抗肿瘤药物领域目前的研究热点，但仍停留在试验阶段[23]，所以寻找诊断、治疗MCT的新型有效方法就变得十分紧迫。分子靶点药物由于其效率高、副作用小已被国内外越来越多的兽医师所重视，虽然还有很多有待进一步研究的方面，但是分子靶点药物治疗方法必定会成为小动物临床未来的主要发展方向之一。考虑到分子靶点药物价格较昂贵，盲目地使用会造成很大浪费，因此必须在使用该药物前进行c-kit基因突变检测，根据检测结果制定的治疗方案会使分子靶点药物有的放矢、效果更加确实。综上所述，在我国小动物临床开展犬MCT的c-kit基因突变检测诊断是十分有意义且必要的。

希望这篇论文能对我国小动物临床医生和科研工作者有所启发，使我国患MCT的犬猫也能早日受惠于c-kit基因突变检测带来的更加具有针对性的治疗方案。

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Progress on Diagnosis of Canine Mast Cell Tumors

LI Ge-bin,YANG Zi-yan,XIA Zhao-fei

(CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing,100193,China)

Mast cell tumors (MCT) represent the most common cutaneous tumors in the dogs and their metastatic and mortality rate are high.Therefore,it is necessary to have better understanding of novel,effective and therapeutic strategies for control of MCT.The present study introduced two classic pathology grade systems of MCT.One is Patnaik system,the other is kiupel System.Meanwhile,this study described the physiological function and diagnostic value of c-kit gene and the protocol of checking a mutation in the c-kit gene.This study highlighted the relationship between c-kit gene mutation and diagnosis,pathology grading,treatment and prognosis in MCT dogs.

canine; mast cell tumor; diagnosis

2015-06-10

中央高校基本科研业务费专项资金(2015QC011)

李格宾(1985-)，女，北京人，讲师，博士，主要从事小动物肿瘤学研究。△同等贡献作者 *通讯作者

S854.4

A

1007-5038(2016)01-0106-04