弯曲菌对临床常用抗菌药物耐药机制研究进展

姚 红，吴聪明，汪 洋

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)



弯曲菌对临床常用抗菌药物耐药机制研究进展

姚 红，吴聪明，汪 洋*

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

弯曲菌(Campylobacter)是一类重要的人畜共患病原菌，能引起人与动物的多种疾病。由于抗菌药物的广泛应用，导致了多药耐药弯曲菌逐年增多，一旦耐药弯曲菌通过食物链传播给人，将会给临床弯曲菌病的治疗带来巨大困难。弯曲菌耐药性的产生主要是由于药物作用靶位点突变、耐药基因的水平传播及多药耐药外排泵引起。论文对临床常用于治疗弯曲菌感染的抗菌药物杀菌机理和其耐药机制做一综述，为有效控制弯曲菌耐药性的产生、传播和公共卫生提供参考。

弯曲菌；耐药性；耐药机制；公共卫生健康

弯曲菌是一类重要的食源性病原菌，属于变形菌门，弯曲菌目，弯曲菌科，弯曲菌属的革兰阴性菌，长0.5μm～5μm，宽0.2μm～0.8μm，菌体呈逗点状、弧状、海鸥展翅状，无荚膜，无芽胞。弯曲菌是微需氧菌，在5% O2、10% CO2、85% N2的气体条件，温度为42℃环境下生长良好。基因组较小，约1.6Mbp～1.7Mbp，A+T含量丰富，G+C含量大约为29mol%～34mol%[1]。弯曲菌通常寄生于动物和人的生殖器、肠道和口腔中。食用被弯曲菌感染的肉类和牛奶可以引起弯曲菌肠炎。家禽被认为是造成人类弯曲菌感染的主要来源。弯曲菌通常情况下不会造成动物的临床疾病，但是不少研究已证实弯曲菌可以导致一些疾病的发生[2]，如可以引起牛和绵羊的流产、火鸡的肝炎和蓝冠病以及仔猪的腹泻等[1]。人感染弯曲菌的潜伏期平均为3.2d，主要临床症状是急性肠炎，伴有腹部疼痛、发热、头痛、恶心和呕吐。弯曲菌还可导致胆囊炎、胰腺炎及消化道大出血，移行至胃肠道外会引起脑膜炎，心内膜炎、脓毒性关节炎、菌血症、败血症及流产等多种疾病，神经性疾病格林-巴利综合征的发生与弯曲菌感染密切相关[3]。在许多国家，由弯曲菌造成的感染已经超过沙门菌、大肠埃希菌和志贺菌。临床常用于治疗弯曲菌感染的药物为氟喹诺酮类、大环内酯类等药物。氨基糖苷类药物作为替换药物可用于治疗弯曲菌引起的全身感染。弯曲菌对多种临床常用抗菌药物耐药性已经出现并逐渐增多，导致临床抗菌药物治疗效果显著下降，疾病迁延不愈等严重后果。本文阐述了临床常用于治疗弯曲菌感染的抗菌药物杀菌作用机制及弯曲菌对其相应的耐药机制。

1 氟喹诺酮类

1.1 氟喹诺酮类抗菌药物杀菌作用机理

氟喹诺酮类药物，如环丙沙星对革兰阳性菌和阴性菌都具有广谱抗菌效果，用于细菌感染的治疗和预防。其杀菌机理是抑制菌体DNA合成，细菌中的拓扑异构酶Ⅱ-DNA促旋酶及拓扑异构酶Ⅳ是该类药物的主要作用靶点。DNA促旋酶催化ATP依赖的DNA负超螺旋，从而影响DNA的复制。在细菌细胞内，一旦氟喹诺酮类药物和靶位酶形成稳定的复合物，便会使DNA与酶分离，稳定形成的复合体，造成DNA双链结构被破坏，从而阻碍DNA链延伸，导致细菌死亡[4]。

1.2 弯曲菌对氟喹诺酮类药物耐药机制

弯曲菌对氟喹诺酮类药物耐药主要由gyrA基因氟喹诺酮类耐药决定区(quinolone resistance-determining region,QRDR)的位点突变介导[5]。其他细菌(如沙门菌和大肠埃希菌)对氟喹诺酮类高度耐药需要gyrA和parC突变的逐步积累，而弯曲菌中gyrA基因QRDR单一位点突变即可引起对氟喹诺酮类药物的高水平耐药[5-7]。gyrA基因的Thr-86、Ala-70和Asp-90位突变可引起对氟喹诺酮类药物不同水平耐药。其中Thr-86-Ile位点突变最常见，该位点单一突变能介导弯曲菌对氟喹诺酮类药物高水平耐药，而其他突变介导至中介水平[5]。目前，关于GyrB亚基上的突变还没有文献报道。此外，Gibreel A等报道，编码拓扑异构酶parC基因的点突变(Arg-139-Gln)能介导弯曲菌对氟喹诺酮类药物高水平耐药[8]，但随后的研究在弯曲菌中未能成功检测出parC或parE，所以由于拓扑异构酶Ⅳ相关基因突变引起的氟喹诺酮类耐药不普遍。

除了突变机制以外，多重耐药外排泵CmeABC在弯曲菌的固有耐药和获得性耐药中都发挥着重要作用[9]。CmeABC是能量依赖型RND家族外排泵，它由位于染色体上1个三基因的操纵子(cmeA、cmeB、cmeC)编码。CmeABC可减少药物在细菌中的蓄积，可与gyrA突变一同介导弯曲菌对氟喹诺酮类药物耐药。CmeABC的敲除可降低弯曲菌对氟喹诺酮类药物的耐药水平，而过度表达则会增加。该泵的存在有助于gyrA基因的Thr-86-Ile位点突变在短时间内发生，并能在无抗菌药物条件下稳定存在且没有适应性代价，比敏感菌更具有生存优势[10]。因此，CmeABC外排泵和gyrA基因突变共同介导弯曲菌对氟喹诺酮类药物耐药。

目前，弯曲菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制均由染色体编码介导，而由质粒介导的可转移性氟喹诺酮类耐药基因，如qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、aac(6′)-Ib-cr还未在弯曲菌中报道。

2 大环内酯类

2.1 大环内酯类药物杀菌作用机理

大环内酯类药物是由链霉菌产生的弱碱性、亲脂性抗生素，如红霉素等。其对大多数革兰阳性菌、部分革兰阴性菌及支原体具有杀菌作用，是治疗人类由弯曲菌引起的胃肠道疾病的重要药物。大环内酯类药物是蛋白质合成抑制剂，其作用靶位是细菌核糖体50S亚基，结合于新生肽链的出口通道，造成肽链延伸过程中肽酰基-tRNA从核糖体上脱落，从而阻碍菌体蛋白的合成[11]。

2.2 弯曲菌对大环内酯类药物耐药机制

弯曲菌对大环内酯类药物耐药机制包括突变机制、外排泵机制[12-13]及甲基化酶erm(B)介导的耐药机制[14]。

突变机制包括弯曲菌23S rRNA V 域2074和2075(等同于大肠埃希菌的2058位点和2059位点)位点突变。A2074G或A2075G位点突变可介导弯曲菌对大环内酯类抗生素的高水平耐药，A2075G更为常见[5,15]。而有研究报道，给肉鸡饲喂泰乐菌素进行体内诱导产生的A2074G突变更稳定；然而，当无抗性选择压力存在时，此突变不能稳定存在，且菌株会产生适应性代价[12]。弯曲菌23S rRNA基因在染色体上存在3个拷贝，只有在2个或2个以上拷贝发生突变时，才能导致弯曲菌对大环内酯类药物耐药[12,16]。此外，核蛋白体L4(G74D)和L22(86位或98位突变)的突变也能导致弯曲菌对大环内酯类药物耐药[17]。

弯曲菌外排泵CmeABC与突变机制协同介导弯曲菌对大环内酯类药物的高水平耐药[18]。插入失活外排泵CmeABC时，对大环内酯类中低水平耐药的弯曲菌可恢复对大环内酯类药物的敏感，即使在高水平耐药的弯曲菌中也可有效降低对大环内酯类药物的耐药水平[16,19]。另外，加入外排泵抑制剂后对CmeABC有抑制作用，不仅能降低弯曲菌对大环内酯类的耐药水平还能降低耐药突变发生的频率[20]。

由突变机制介导的对大环内酯类药物耐药性不易发生水平传播，且弯曲菌耐药突变株存在适应性代价，在无抗生素压力下会被敏感菌株取代。然而，近年来弯曲菌对大环内酯类药物耐药率仍呈上升趋势。Qin S等[14]研究首次在结肠弯曲菌中发现了介导对大环内酯类药物耐药的甲基化酶erm(B)基因，该基因除介导对大环内酯类药物高水平耐药外，还可介导弯曲菌对林可胺类和链阳菌素B类耐药。此外，该基因还可在弯曲菌中通过自然转化的方式进行水平传播。Wang Y等[21]在禽源空肠弯曲菌中检测到erm(B)基因，更加证明了这一点。

3 氨基糖苷类

3.1 氨基糖苷类药物杀菌作用机理

氨基糖苷类药物也是由链霉菌产生，由氨基糖和氨基环醇通过氧桥连接而成，包括卡那霉素、链霉素、庆大霉素、阿米卡星等，杀菌性较强，广泛用于人和动物。氨基糖苷类药物与核糖体30S亚基发生不可逆结合，扰乱转录的正常进行，使延伸中的肽链从核糖体的A位点转移至P位点，导致蛋白质延伸受阻，为静止期杀菌性抗生素[22]。氨基糖苷类抗生素抗菌谱广，抗菌活性强，尤其是对革兰阴性菌作用强大。

3.2 弯曲菌对氨基糖苷类药物耐药机制

弯曲菌对氨基糖苷类药物耐药主要由钝化酶对药物的修饰介导[23]。APH(3′)类钝化酶共有8个亚型，在弯曲菌中只发现4个亚型，分别为Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅶ型，其中APH(3′)-Ⅰ、Ⅲ和Ⅶ钝化酶在弯曲菌中最为多见[24]。编码APH(3′)-Ⅰ型钝化酶的基因aphA-1为阴性菌特有，首先分离于人源临床肠杆菌。在弯曲菌中发现的编码APH(3′)-Ⅰ型钝化酶的开放阅读框(open reading frame,ORF)与肠杆菌中aphA-1同源性几乎为100%，因此推测弯曲菌中的aphA-1来源于肠杆菌[25]。弯曲菌中aphA-3首先发现于结肠弯曲菌的质粒上，该基因可能来源于革兰阳性球菌，因为其序列与链球菌的序列完全一致，与葡萄球菌仅有2个碱基差异。该基因在弯曲菌中大小不同的质粒上和染色体上均有发现[24]。编码APH(3′)-Ⅶ型钝化酶基因aphA-7多位于质粒上，其G+C%含量与弯曲菌基因组的G+C%含量相似，故推测它是弯曲菌的固有基因。

值得注意的是氨基糖苷类耐药基因不仅可以单独存在，还能以基因簇的形式存在。基因簇aadE-sat4-aphA3最早发现于空肠弯曲菌的一个25.7kb的质粒pCG8245上。Qin S等[26]发现，基因簇aadE-sat4-aphA3存在于结肠弯曲菌的染色体上，同时整合了包含erm(B)等多种耐药基因形成多重耐药基因岛，介导弯曲菌对临床多种常用抗生素高水平耐药。目前已经证实包括该aadE-sat4-aphA3基因簇在内的多重耐药基因岛可以通过自然转化进行水平传播。

此外，核糖体靶位修饰，包括16S rRNA甲基化作用和核糖体靶位突变，在其他细菌中较为常见，但在弯曲菌中尚未有由该机制介导的氨基糖苷类抗生素耐药的报道。

4 四环素类

4.1 四环素类药物杀菌作用机理

四环素类药物是一类重要的广谱活性抗生素，对大多数革兰阳性、革兰阴性菌有活性，广泛用于人和动物。它能和核糖体30S亚基发生可逆性结合，阻碍正在进入的氨酰基-tRNA和核糖体A位点结合，导致延伸过程终止，从而抑制出生多肽链的合成[22]。

4.2 弯曲菌对四环素类药物耐药机制

弯曲菌对四环素类耐药主要由tet(O)基因介导，tet(O)基因广泛存在于动物源弯曲菌。该基因既可定位在质粒上也可定位在染色体上，它能编码核糖体保护蛋白Tet(O)，识别被四环素结合的核糖体复合物上的A位点，并结合至该位点引起构象改变，使四环素类药物释放从而导致耐药。弯曲菌中tet(O)基因序列与革兰阳性菌中该基因同源性高达99% 以上，而且G+C%含量高于弯曲菌，因此推测该基因来源于革兰阳性菌[24]。此外，外排泵CmeABC与tet(O) 基因协同作用导致对四环素类抗生素耐药[9,27]。

5 弯曲菌的固有耐药性

弯曲菌对多种抗生素呈现固有耐药，包括万古霉素、头孢菌素、甲氧苄啶和头孢哌酮等，其中一些用于弯曲菌的分离[28]。虽然弯曲菌对这些药物天然耐药的机制尚不清楚，但很有可能是由于弯曲菌胞膜的特殊结构和外排机制发挥作用[24]。

6 结语

综上所述，弯曲菌对临床常用于治疗弯曲菌病的抗菌药物耐药机制多样。近年来，弯曲菌对大环内酯类和氨基糖苷类抗生素新的耐药机制接连被发现，使其耐药机制越来越复杂，严重威胁公共健康。阐明弯曲菌的耐药机制，有助于弯曲菌病的治疗和新型药物的研发。总之，弯曲菌作为重要的食品动物源性病原菌和人畜共患病原菌应被予以高度重视。

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Progress on Mechanisms of Campylobacter Resistance to Antimicrobials Frequently Used in Clinic

YAO Hong,WU Cong-ming,WANG Yang

(CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing,100193,China)

Campylobacteris a significant zoonotic pathogen which can lead to diverse diseases in humans and animals.Because of the extensive use of antibiotics,multiple drug resistance toCampylobacteris increasing.It will threaten the public health once the resistantCampylobacterinfect humans through food chain.The main mechanisms of antimicrobial resistance inCampylobacterare mutation of antimicrobial target sites,the spread of resistance gene,and efflux mechanism.Here we reviewed the bactericidal mechanism of antimicrobials which are frequently used in clinic and the resistance mechanisms ofCampylobacterto them.We hope that it can supply scientific basis to control the emergence and the spread of resistantCampylobacterand provide guarantee for public health.

Campylobacter; antimicrobial resistance; resistance mechanism; public health

2015-05-31

国家重点基础研究发展计划项目(2013CB127200)；国家自然科学基金项目(U1031004)

姚 红(1988-)，女，北京人，博士研究生，主要从事细菌耐药性研究。*通讯作者

S852.613

A

1007-5038(2016)01-0096-04