血吸虫核酸诊断方法研究进展*



·综述·

血吸虫核酸诊断方法研究进展*

孙莉军1，叶青2，赵友云3，齐自慧2，杨梦歌2#综述,王业富2△#审校

(1.湖北省临床检验中心，湖北武汉 430064；2.武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室，

湖北武汉 430072；3.湖北省中医院，湖北武汉 430061)

关键词:血吸虫病；早期诊断；核酸诊断

血吸虫病是由裂体吸虫属血吸虫引起的一种热带性疾病。主要通过接触血吸虫疫水，尾蚴经接触部位的皮肤、黏膜侵入人体而造成感染。根据WHO报告，全世界有超过2亿人感染血吸虫病，孩童的感染率高于成人，我国是日本血吸虫病流行最严重的4个国家之一。血吸虫病的诊断通常是通过显微观察排泄物中的虫卵来确定[1]。但这种方法的灵敏度不高，粪便中排出虫卵分布不均匀和排出量的波动性会对结果的准确性造成影响[2]。现行主要的血吸虫病诊断方法包括病原学诊断、免疫学诊断和核酸诊断，另外还有超声诊断技术，条形码技术诊断等方法诊断血吸虫病[3]。现有研究表明核酸诊断对发现血吸虫早期感染有较明显优势，本文就核酸诊断的方法进展作一综述。

1聚合酶链式反应法

PCR采用DNA聚合酶，以单链DNA为模板，以脱氧核苷酸为底物合成DNA。到如今PCR已发展到第三代技术。在常规PCR的基础上，演变出了荧光定量PCR、巢式PCR等一系列PCR技术。

1.1常规PCR法常规PCR法是提取患者的粪便、尿液与血液中的血吸虫DNA为模板用于PCR检测的一种核酸检测方法。有研究表明，在最初的感染后4周，在宿主体内血清中的日本血吸虫DNA主要来自于死亡的血吸虫蚴体和血吸虫在生长过程中的外皮脱落物。这就为血吸虫的早期检测核酸引物设计奠定了基础[4]。陆正贤等[5]探索了PCR检测法在日本血吸虫感染早期检测的特异性和敏感性。最终能在早期感染后1周在日本血吸虫的成虫、虫卵、日本血吸虫感染家兔的肝组织、粪便和外周血清中均扩增到相对分子质量为230 bp的特异性阳性条带，比粪检法和免疫学方法早3～6周。该方法首创在感染第1周即能扩增出特异性DNA阳性条带，且从日本血吸虫感染宿主血清中检测出特异性DNA。说明PCR检测法具有一定的疗效考核价值。Lodh等[6]用滤纸过滤尿液沉降物，提取其中物种专一性的重复片段，使用曼氏血吸虫和埃及血吸虫的特异引物PCR扩增，相比粪检虫卵法，PCR扩增特异性引物有着更高的敏感性和特异性。此种方法有着更高的敏感性和特异性，可以检测粪检法和血尿症未检测出来的患者。此外，此种方法可使用单个尿液标本单个或同时检测出曼氏血吸虫和埃及血吸虫。

1.2荧光定量PCR荧光定量PCR(FQ-PCR)是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。秦圆方[7]在国内首次建立了SYBR GREEN荧光定量粪检PCR法，建立了粪样虫卵数与定量PCR结果的定量关系，可望以PCR法精确测定日本血吸虫感染度。此方法具有灵敏度高、特异性强、可估计感染度等优点。18SrRNA是核糖体RNA中的一类，存在核糖体当中与其他核糖体RNA和核糖体蛋白构成核糖体参与蛋白质的翻译，18SrRNA经研究具有很高的保守性，且在血吸虫基因组中拷贝数相当大。周立等[8]根据日本血吸虫18S小亚基单位核糖体核酸(18SrRNA)基因设计特异性引物进行PCR扩增检测克隆后的日本血吸虫18SrRNA基因。最终重复性试验表明稳定性好，整个实验可在3 h内完成对样品的检测，用时短，最低能够检测出6.15 pg的血吸虫18SrRNA，灵敏度高。王本敬[9]通过比较4种基因：pSjrh1.0、18SrRNA、SjR2的G55A克隆在基因组中的丰度，初步确定SYBR Green I荧光实时定量PCR(RQ-PCR)方法检测日本血吸虫的较适宜靶基因和反应条件。结论表明RQ-PCR具有较高的准确性、特异性。官威[10]建立了一种灵敏，高效的日本血吸虫Taqman real-time PCR定量检测法，选取日本血吸虫高度重复基因SjR2为靶序列设计引物和Taqman探针，和曼氏血吸虫、肝吸虫、旋毛虫、肺吸虫均无交叉反应，检测日本血吸虫SjR2基因重组质粒梯度最小浓度为4.47×10 copies/μL，表明荧光定量PCR检测法敏感度高、特异性强，具有潜在的应用价值。

1.3巢式PCR巢式PCR是一种变异的PCR，使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物，结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。刘爱平等[11]通过优化巢式PCR反应体系，在低存活量的成虫感染家兔血清中3 d即可扩增到特异性目的条带，检出血吸虫成虫，具有很高的敏感性。Guo[12]筛选出了一段相对分子质量为303 bp的序列作为DNA检测的靶序列，能够快速在感染血吸虫的家兔血清中扩增到目的片段。童群波等[13]选取日本血吸虫高拷贝420 bp的Sjα1基因片段，设计了2对巢式引物扩增该基因片段，2周即能从血清和全血样本中检出特异性DNA。

2LAMP法

环介导等温扩增技术(LAMP)于2000年由日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上首次公开发表。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60～65 ℃恒温扩增，15～60 min左右即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点[14]。

许静[15]在参考陆正贤已建立的常规PCR法检测血吸虫病的基础上，建立了LAMP法，LAMP法的灵敏性和特异性均高于PCR法，且敏感性显著高于PCR法，约为PCR法的104倍。在疗效考核的实验中，LAMP法较PCR法晚一周转阴，即第13周时转为阴性，显示出其具有更高的敏感性。曹仁祺[16]建立了粪便中血吸虫虫卵的LAMP检测方法和PCR检测方法，选取日本血吸虫基因组中高度保守的多拷贝重复序列rbp基因为靶序列进行LAMP引物设计。不仅显示出较PCR更高的敏感性，且对牛常见的病原体也有较好的特异性。王岑[17]选取了4种日本血吸虫基因组重复序列作为扩增片段，并且筛选出一组特异性强、敏感性高的引物，优化反应体系和反应条件，建立了一种检测全血的简便、快速和高敏感性LAMP方法。

3基因芯片检测

基因芯片检测是一块带有DNA微阵列的特殊玻璃片或硅芯片片，在数平方厘米之面积上布放数千或数万个核酸探针；检体中的DNA、cDNA、RNA等与探针结合后，借由荧光或电流等方式侦测。经由一次测验，即可提供大量基因序列相关信息。它是基因组学和遗传学研究的工具。

周钧等[18]运用基因芯片技术与曼氏血吸虫、埃及血吸虫及其他所有基因进行BLAST，均无同源性。基因芯片可一次性大规模检测日本血吸虫，尤其适用于血吸虫病流行区现场的检测及监测，该方法解决了操作效率低和结果客观性差等问题，具有快速、灵敏、特异性等优势，可获得准确、可靠的日本血吸虫病流行病学资料，为及时地报告疫情，有效遏止疫情提供保障[19]。

基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，研究人员应用基因芯片就可以在同一时间定量地分析大量(成千上万个)的基因表达，具有信息量大、快速、可进行高通量筛选以及数据一致性好等优势[20]。有相关报道利用基因芯片技术分析曼氏血吸虫不同性别成虫接触后诱导的基因表达情况[21]。也有报道利用基因芯片技术分析日本血吸虫尾蚴阶段高表达的基因[22]。通过侵入，尾蚴将经历巨大的变化，并且释放分泌产物以适应新环境并且逃避宿主的免疫攻击，利用基因芯片技术分析日本血吸虫在尾蚴阶段高表达的基因对研究血吸虫的检测也具有深远意义。

4小结

血吸虫病仍然是我国流行病防治重点工作之一，根据2012年全国血吸虫病疫情通报，截至2012年底，全国仍至少有24万血吸虫患者[23]，我国日本血吸虫病流行形势仍然严峻。能够在疫区建立快速准确诊断血吸虫病的方法是一种发展趋势，而核酸检测因其高敏感性、高特异性逐渐成为检测血吸虫病方法的热门研究方向。同时，根据生物信息学方法、基因比对方法等，针对不同靶序列片段的核酸诊断方法也在进一步研究，但目前为止尚未见到用于血吸虫病流行疫区现场的核酸诊断报道。推测其原因可能有：(1)DNA的在标本的提取过程中会有损失，无论是通过粪便或是血清提取血吸虫DNA，因其复杂的提取过程、提取方法、提取试剂盒的不同，都会对血吸虫基因组DNA造成一定的损失，而多拷贝的靶基因能够在一定程度上弥补DNA提取有损失的缺陷。(2)通常在实验室的研究方法是建立实验动物模型，实验动物模型中很多因素可人为控制，如选择相同大小天数的家兔、感染相同数量的血吸虫等，而疫区患者具有个体的差异性、自身的复杂性和感染病原体的多样性。综合上述情况对现场核酸检测均会造成一定影响。(3)实验条件和实验操作限制了现场核酸检测，大部分的核酸检测都需要运用PCR仪等，而LAMP技术对实验环境要求极高，这些客观条件都会对现场核酸检测造成一定的限制和影响。(4)用于扩增靶序列的基因种类有限，目前研究较多用于扩增靶序列的基因主要有来源于曼氏血吸虫的121 bp高度重复序列、18SrRNA基因、逆转录子SjR2、Sjrh1.0、线粒体DNA等，这些靶序列的特异性和敏感性在面临现场核酸检测时仍不够理想。

理想的诊断检测方法应具备准确度高、敏感度高、易于操作、价格低廉，尽量无创等特点。对于一些诊断来说，早期诊断和治疗在阻止长期并发症或者阻断致病因子的传播方面发挥着重要作用[24]。Zhou等[25]根据日本血吸虫18S小亚基单位核糖体核酸(18SrRNA)基因设计特异性引物进行荧光定量PCR扩增检测克隆后的日本血吸虫18SrRNA基因，可以检测到10 fg的日本血吸虫，比传统的PCR检测灵敏100倍。同时，也能够在感染后1周的小鼠血清中检测到日本血吸虫，在感染后4周的小鼠排泄物中检测到日本血吸虫，比镜检粪便中的虫卵早了一个星期。LAMP虽然灵敏度也较高，反应时间短，但LAMP方法对实验环境要求太高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，假阳性问题比较严重。且相比荧光定量PCR方法，LAMP不能定量。荧光定量PCR相较传统PCR特异性更强，通过引物和探针设计的“双保险”，能够避免检测的假阳性。且灵敏度更高，分析PCR产物的对数期，通过自动化仪器收集的荧光信号，避免了人为因素干扰,且荧光定量PCR不需要对扩增产物进行后续实验分析，操作简单。而巢式PCR相较于荧光定量PCR的灵敏度也较低。目前核酸检测技术中易于操作这一项仍有很大的提升空间，而准确度和敏感度的提高，随着技术和研究的不断发展，可以用生物信息学寻找特异性和敏感性更高的靶序列。随着对实验环境和条件的降低，实验操作步骤的简化，血吸虫核酸检测的成本也能随即下降。在无创方面，可以多开发针对粪便的检测方法，而唾液、尿液也可以选作检测样本进行开发研究，以简化取样，减少患者取样这一过程带来的创伤。

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(收稿日期：2015-07-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.01.032

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)01-0074-03

*基金项目：湖北省自然科学基金项目(2013CFB461)。

作者简介：孙莉军，女，湖北省临床检验中心主任医师，主要从事临床微生物学检验质量管理和临床实验室管理研究。△通讯作者，E-mail：wangyefu@whu.edu.cn。