鱼类无乳链球菌病
2016-03-10程世亮刘新风黄艺丹
程世亮,刘新风,郑 文 ,黄艺丹 ,张 君 ,郑 建*
(1.山东省交通医院检验科,山东济南 250101;2. 奥创生物技术(山东)有限公司,山东济南 250101)
专论与讲座
鱼类无乳链球菌病
程世亮1,刘新风1,郑文1,黄艺丹2,张君2,郑建2*
(1.山东省交通医院检验科,山东济南 250101;2. 奥创生物技术(山东)有限公司,山东济南 250101)
摘要:无乳链球菌亦称为B组链球菌,是一种在自然界广泛存在的革兰阳性菌, 是人类的重要病原之一, 也是鱼类的重要病原菌。近年来,无乳链球菌成为鱼类链球菌病的主要病原之一,鱼类感染无乳链球菌的常见临床症状包括眼球突出、腹部肿胀、脊骨弯曲、鳍条基部出血等,发病率和死亡率高,常造成严重的经济损失,危害着水产养殖业的健康发展。论文对鱼类无乳链球菌病的研究进行了总结,对鱼类无乳链球菌病病原、致病机理进行综述,介绍了鱼类无乳链球菌病常见的诊断方法,以及现阶段针对鱼类无乳链球菌病的疫苗开发情况,旨在进一步丰富、完善鱼类无乳链球菌病的研究资料,为更好的防治鱼类无乳链球菌病提供参考。
关键词:无乳链球菌;鉴定;致病机理;疫苗开发
近年来,无乳链球菌已成为水生动物链球菌病的主要病原之一。无乳链球菌(Streptococcusagalactiae),属于链球菌科(Streptococcace),链球菌属(Streptococcus),亦被称为B组链球菌(Group BStreptococcus, GBS),为兼性厌氧革兰阳性的链状球菌,能够感染野生或养殖的水生动物[1-3]。虽然无乳链球菌能够感染不同宿主,但是鱼源无乳链球菌的基因表达能使其更好的适应鱼类宿主[4]。据报道,异源的无乳链球菌也能够引起鱼类感染[5],不同来源的无乳链球菌对鱼类的致病性有所不同[6]。 无乳链球菌在自然界广泛存在,所引起的鱼病通常在26℃以上水温发生, 近年来,鱼类无乳链球菌病越来越受到关注,其发病率和死亡率高,常造成严重的经济损失,影响水产养殖业的健康发展。
1无乳链球菌病病原与症状
无乳链球菌为兼性厌氧革兰阳性链状球菌,直径约0.5 μm ~2.0 μm,在液体培养基中成对或链状排列,无芽胞、无鞭毛, 氧化酶阳性、过氧化氢酶阴性, 接种于血平板时呈β-溶血,部分为非溶血性(γ-溶血)[7],最适生长温度为28 ℃~37 ℃。鱼类感染无乳链球菌的临床症状包括食欲减退、单侧或双侧眼球突出、眼球出血、角膜混浊、腹部肿胀、脊骨弯曲、鳍条基部出血等。病鱼剖检后可见腹腔血性腹水,胃肠道充血和腔壁变薄,脑膜充血,肝脾肿大,充血,心外膜有类纤维素样物质沉积,组织病理主要表现为肝脏、脾脏和肾脏细胞变性、坏死和炎性水肿,心肌炎和心外膜炎,脑膜炎和脑基质炎性水肿,卡他性胃肠炎,鳃小片炎性水肿和上皮细胞坏死、脱落[8]。
2无乳链球菌致病机理
2.1致病途径
无乳链球菌主要通过病鱼的引入而在渔场间传播,高温、低溶氧和水体富营养化等环境因素会引起鱼类产生应激反应,降低鱼体对无乳链球菌的抵抗力。无乳链球菌入侵鱼体的主要途经是通过胃肠道进入[9],其表面的菌毛样结构,与该菌的定植、黏附和侵袭相关[10]。此外,无乳链球菌能够逃避鱼体的免疫吞噬和清除,并在鱼体内迅速繁殖扩散,进一步加剧组织器官的病理损伤[8]。无乳链球菌穿透罗非鱼的血脑屏障,进入脑组织后引起不同程度的组织病变,导致发病罗非鱼出现游动失衡、定向障碍等症状[8]。
2.2主要毒力因子
2.2.1荚膜多糖荚膜多糖(capsular polysaccharides, CPs)是特异性多糖,位于细菌表面,是无乳链球菌的主要毒力因子。无乳链球菌血清型是由荚膜区域的血清特异基因决定的,目前已知的血清型有10种血清型( Ia、Ib、Ⅱ-Ⅸ型)。免疫电镜技术显示,Ia、Ⅱ和Ⅲ型无乳链球菌的荚膜多糖含量较Ib型多[9]。cpsA、cpsB、cpsC、cpsD、cpsE、cpsL、neuB、neuD、neuA和neuC这10个基因在无乳链球菌的所有血清型中均高度保守[11],cpsB到cpsJ, cpsL和cpsM存在于鱼源无乳链球菌基因组中[12],鱼源cpsE基因推导氨基酸序列也具有高度保守性,与人源、动物源无乳链球菌相似性达100%[13]。
2.2.2表面抗原无乳链球菌存在多种表面蛋白,已报道了无乳链球菌上存在的一些潜在的抗原能够刺激机体产生保护性抗体,这些抗原包括Cα和Cβ,Rib,表面免疫蛋白(surface immunogenic protein, Sip), C5a肽酶等[14-17]。但是在大部分无乳链球菌菌株中,仅有Sip和C5a肽酶在基因水平上保守[16-18]。Sip蛋白是位于B群链球菌表面的一种蛋白,亦能够被分泌到细胞外,该蛋白在9种血清型的菌株中均有表达(尚未知血清型Ⅸ中是否存在Sip蛋白)[16],具有高度保守性以及良好的抗原性[19]。ScpB 是无乳链球菌表面蛋白C5a肽酶 (streptococcol C5a peptidase from group BStreptococcus)的简称, 可以裂解人 C5a 补体的 His-67, 抑制炎症反应,对细菌黏附和入侵靶细胞及引起机体免疫反应起介导作用,且存在于各个血清型中[20]。scpB 基因也存在于罗非鱼源的无乳链球菌中,与人源无乳链球菌scpB 基因核苷酸序列的同源性为99.7%[21],说明scpB基因与无乳链球菌在鱼体内实现黏附和定植有关。
致病机理的研究对疾病采取正确有效的防治措施息息相关,目前针对无乳链球菌对鱼类的致病机理研究的还不够透彻,需要进一步利用免疫学、分子生物学等技术对无乳链球菌毒力因子的致病机制进行研究,揭示毒力因子与无乳链球菌发病的关系,才能为鱼类无乳链球菌病的积极有效的防控打下基础。
3无乳链球菌病的诊断
由于鱼类疾病的一些临床症状,例如单侧或双侧眼球突出症状的出现,不仅仅由于一种原因引起,可能是因为病鱼营养素缺乏,也可能是由气单胞菌、爱德华氏菌、弧菌和链球菌等细菌引起。因此,要对鱼类无乳链球菌病采取进一步的治疗措施,首先需要借助微生物学、血清学或者分子生物学等方法对无乳链球菌病进行快速高效的诊断。
3.1微生物学方法
从病鱼的脑,心脏、肾脏、脾脏或肝脏中取样,按常规细菌分离鉴定方法包括菌落形态特征、菌株生化鉴定等,已有商品化的链球菌生化鉴定试剂盒可进行无乳链球菌的鉴定,如Vitek-Gram positive 和 API rapid strep 32等。
3.2分子生物学方法
目前鱼类细菌病常见的分子生物学诊断方法包括基于通用引物的16 S rRNA序列分析技术,靶向于某些编码基因的特异性PCR诊断方法和核酸杂交技术等。多重PCR法是鉴定无乳链球菌的常见方法,在同一反应体系中加入多对引物,扩增不同的特异性区域。根据罗非鱼源无乳链球菌16 S rRNA基因和sip基因序列[22],和根据鱼源无乳链球菌荚膜多糖的cpsF基因和CAMP因子的cfb基因序列[23]建立的双重PCR,能够特异性针对无乳链球菌,其他常见水生动物致病菌均无条带检出。与双重PCR检测法比较,三重PCR法灵敏度更高,根据sip、cpsE和cpsL 基因为引物建立的检测三重PCR法,对无乳链球菌DNA样本的最低检测浓度为0.32 ng/μL,能区别其他7种包括海豚链球菌在内的常见鱼类病原菌[24]。以无乳链球菌cpsE基因为模板设计特异性引物和寡核苷酸探针,建立的间接原位PCR方法[8]可以检测无乳链球菌在鱼体内的动态分布,是研究无乳链球菌对鱼类致病机理的有效方法。巢式PCR也被用于检测存在于冰冻和石蜡块包埋的罗非鱼组织中的无乳链球菌,该方法具有高度特异性,不会扩增海豚链球菌(S.iniae)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)等其他鱼类致病菌16 S-23 S rRNA区域[25],可作为诊断和流行病学检测的工具。
3.3免疫学方法
使用多克隆抗体进行的免疫组织化学法也被用于鱼类无乳链球菌的诊断[26],但该方法耗时较长,不能用于对鱼源无乳链球菌进行快速诊断。BioStar®OIA®STREP B能够特异性针对无乳链球菌糖抗原,通过抗原抗体反应,对人源无乳链球菌进行快速鉴定。笔者用灭活的鱼源无乳链球菌全菌开发的单克隆抗体,仅能针对免疫的菌株,对其他菌株反应效果不佳(未发表结果),因此需要使用在所有无乳链球菌血清型中都存在的蛋白作为抗原,制备单克隆抗体,才能更好的检测不同血清型的无乳链球菌。Matsui H等[27]用重组Sip蛋白以及根据Sip蛋白氨基酸残基序列的合成肽作为抗原制备单抗,在此基础上研制的胶体金试纸条可检测106CFU/mL的人源无乳链球菌,9种不同血清型,特异性99.6%,敏感性93.1%。目前尚未发现用Sip蛋白开发单克隆抗体以及检测试纸条应用于鱼类无乳链球菌病诊断的报道。与人源无乳链球菌的快速诊断不同,鱼类无乳链球菌病的诊断运用还局限于传统的细菌学分离鉴定和分子生物学鉴定方法,运用免疫原理进行快速诊断的报道较少。尽管免疫学方法在人源无乳链球菌鉴定方面取得了一定成果,但是由于菌株之间存在的差异,尚不清楚这些检测方法对鱼源无乳链球菌特异性和敏感性如何。
4防治措施
4.1加强饲养管理
采取科学的饲养管理方式,如加强养殖水质的监控和对外来鱼种的检疫、避免过度投料、控制养殖密度、及时处理病鱼和死鱼、保持良好的卫生条件以及定期清洁消毒生产工具等等,尽可能的切断病原传播的途径,能有效降低无乳链球菌病暴发的风险。
4.2药物治疗
化学药物治疗是我国鱼类疾病控制最常见的方式,有报道无乳链球菌对阿莫西林、强力霉素和利福平等药物敏感[28]。然而,长时间使用抗生素治疗,细菌容易对药物产生不同程度的耐药性,加上药物残留等问题,证明了抗生素治疗手段并不是可持续的鱼类疾病防控方式,要从根本上解决这一问题,还需要利用科学的方法研制针对无乳链球菌的疫苗。
4.3疫苗研究
由于使用抗生素治疗鱼类疾病会引起耐药菌产生、药物残留等多种问题,使用疫苗对无乳链球菌病的防控就成了目前国内外研究的重点。经过无乳链球菌灭活疫苗免疫的罗非鱼对无乳链球菌的抵抗力显著提高,以注射法进行第二次免疫后的相对保护率为78.33%[29]。用对司帕沙星耐药筛选的无乳链球菌菌株制备减毒活苗免疫10 g~12 g的罗非鱼,保护率可达75%~100%,同时使用含30株弱毒无乳链球菌制成的多价苗免疫罗非鱼,该多价苗可对不同无乳链球菌菌株攻毒的罗非鱼起到极显著保护作用(P<0.001)[30],说明无乳链球菌多价苗能对罗非鱼提供广泛的保护力。
灭活的全菌疫苗由于安全性好,制备简单,在水产养殖过程中应用广泛,但是全菌灭活苗的不同抗原成分对免疫效果会有影响,而弱毒疫苗毕竟是一种活疫苗,不排除毒力恢复的可能。因此,使用基因工程学和分子生物学手段,将无乳链球菌中能刺激鱼体产生保护性作用的抗原分离,进行疫苗研究,成了一个重要的研究方向。蛋白疫苗的开发,将会成为水产疫苗发展的主要方向,其优点在于制备容易、使用剂量少、效果稳定等。然而,无乳链球菌中不同的蛋白的免疫效果不尽相同,起到的保护力各不相同,因此选择理想的蛋白进行疫苗开发,是近年来的研究热点。尽管无乳链球菌纤维蛋白原结合蛋白A(FbsA)和α-烯醇酶能调节罗非鱼的先天免疫反应和特异性抗体反应,FbsA免疫的血清滴度(1∶1 600)高于α烯醇酶(1∶400),但是重组的α-烯醇酶提供的相对免疫保护率更高(62.50%±18.75%)[31],说明α-烯醇酶更适合作为疫苗研究的对象。尼罗罗非鱼经ScpB 蛋白免疫后,鱼体内IgM抗体水平迅速升高并能在一段时间内维持在一个较高的水平,对罗非鱼的相对保护率达89%[17],说明该蛋白在罗非鱼体内具有很好的免疫保护效果,将ScpB蛋白作为疫苗开发有一定的应用前景。Liu G等[32]鉴定了16种无乳链球菌的免疫反应蛋白,发现4种蛋白:富丝氨酸重复糖蛋白1(serine-rich repeat glycoprotein 1)、支链α酮酸脱氢酶亚单位E2(branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase (BKD) subunit E2)、5′- 核苷酸酶家族蛋白(5′-nucleotidase family protein)和鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ornithine carbamoyl transferase),能与兔高免血清、豚鼠血清和无乳链球菌感染的罗非鱼血清反应,可作为疫苗研究的对象。经Sip亚单位疫苗免疫的小鼠血清中抗体滴度可达5 851 428±2 189 404,极显著高于全菌灭活苗组(8 000±2 962)[33],免疫后的小鼠对Ia、Ib、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ 6种不同血清型的无乳链球菌均能产生免疫力[16], 说明Sip蛋白有潜力成为抗无乳链球菌的通用候选疫苗。用重组表达的Sip蛋白免疫罗非鱼,免疫保护率达70.3%[34]。利用减毒鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)SL7207作为载体开发的编码Sip蛋白的DNA疫苗SL/pVAX1-sip,对罗非鱼的毒性低,且能使罗非鱼对野生株无乳链球菌攻毒产生有效保护作用[35]。
由于免疫的方法、养殖环境、鱼类自身的差异等因素影响,能在水产养殖中运用的商品化无乳链球菌疫苗目前正处于起步阶段。无乳链球菌血清型较多,各血清型之间无交叉保护力,加上无乳链球菌的来源不同,各菌株的表面抗原表达情况也不相同,所以用灭活全菌作为免疫原,得到的抗体通常都是有菌株依赖性的,而选择在各血清型之间都有的保守性抗原作为候选抗原疫苗,确保不同血清型间产生交叉保护力,是疫苗开发的一个重要方向。
5展望
目前对鱼源无乳链球菌的研究多集中在不同血清型菌株的分离鉴定以及疫苗研发上,并取得了一定成果,但是关于无乳链球菌对鱼类的致病机理仍然研究不够透彻。近年来,由无乳链球菌引起的疾病给世界范围内的水产养殖业造成巨大的损失,要做到切实有效的避免鱼类无乳链球菌病的暴发和传播,建立完善的监测机制,及时采样送检以及使用快速准确的方法进行诊断,进一步加强对该菌对于鱼类侵染机制的研究,促进疫苗的开发和应用,才能为更好的防治鱼类无乳链球菌病提供依据。
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StreptococcusagalactiaeInfection in Fish
CHENG Shi-liang1, LIU Xin-feng1, ZHENG Wen1, HUANG Yi-dan2,ZHANG Jun2, ZHENG Jian2
(1.ClinicalLaboratory,ShandongJiaotongHospital,Ji'nan,Shandong,250101,China;2.ArtronBiotechnology(Shandong)Inc,Ji'nan,Shandong, 250101,China)
Abstract:Sterptococcus agalactiae, also called group B Streptococcus, is a worldwide-distributed Gram-positive bacterium. It is a major bacterial pathogen to humans, and also to fish. Recently, S. agalactiae has become one of the major causes of streptococcosis in fish. The clinical signs of fish infected with S. agalactiae include exophthalmia, distended abdomen, curvature of the spinal cord, bleeding at the base of the fins, etc. Due to its high morbidity and mortality, the disease caused by S. agalactiae leads to serious economic loss and threats the sound development of aquaculture. This paper overviewed the research progress on the fish disease caused by S. agalactiae, and introduced its pathogenesis, the methods of identification and the current development of vaccines against S. agalactiae from fish in order to provide references for the further investigation on S. agalactiae, as well as the disease control and prevention in aquaculture.
Key words:Streptococcus agalactiae; identification; pathogenesis; vaccine development
文章编号:1007-5038(2016)02-0105-05
中图分类号:S852.611
文献标识码:A
作者简介:程世亮(1981-),男,山东济南人,学士,主要从事微生物实验室诊断研究。 *通讯作者
收稿日期:2014-10-09