过表达miRNA-291b-3p诱导H9C2细胞胰岛素抵抗

隋小芳，李雪杰，王凤玲*，索树珍，杨　军，董天崴，张磊艺

(1.佳木斯大学附属第一医院 老年病科；2.佳木斯大学老年医学研究生;

3.佳木斯大学附属第一医院 心内科，黑龙江 佳木斯154002)



过表达miRNA-291b-3p诱导H9C2细胞胰岛素抵抗

隋小芳1，李雪杰2，王凤玲1*，索树珍2，杨军3，董天崴3，张磊艺3

(1.佳木斯大学附属第一医院 老年病科；2.佳木斯大学老年医学研究生;

3.佳木斯大学附属第一医院 心内科，黑龙江 佳木斯154002)

摘要：目的研究过表达miRNA-291b-3p对诱导H9C2细胞胰岛素抵抗的影响。方法①用10 ng/ml TNF-α处理心肌细胞系H9C2细胞24 h，通过Real time PCR检测 miR-291b-3p表达水平，Western blot 分析AKT/GSK信号通路活性，用蒽酮法检测细胞糖原水平；②构建miR-291b-3p mimics 腺病毒载体，感染H9C2细胞48 h，分析miR-291b-3p水平、AKT/GSK 信号通路活性和糖原水平的变化。结果①TNF-α处理H9C2细胞24 h，miR-291b-3p 的表达水平明显升高，同时AKT/GSK信号通路活性受到抑制，心肌细胞糖原水平升高；②miR-291b-3p mimics腺病毒感染H9C2细胞48 h，miR-291表达水平升高，AKT/GSK信号通路活性降低，心肌细胞糖原水平升高。结论H9C2细胞中TNF-α或过表达miR-291b-3p可抑制AKT/GSK 信号通路活性，出现胰岛素抵抗。

关键词：心肌细胞；胰岛素抵抗；miR-291b-3p；TNF-α

(ChinJLabDiagn,2016,20:0182)

近几年研究发现，胰岛素抵抗(I R)在冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生和进展过程中起到至关重要的作用,是连结多种代谢性异常和心血管疾病的中心环节[1]。随着对miRNAs的深入研究，越来越多的结果表明，miRNAs广泛参与人类疾病的发生过程[2]。最近研究表明，miRNA 参与调控心血管系统的发育和疾病发生过程。在心肌胰岛素抵抗中miRNAs发挥的作用及其机制尚不明确。深入探讨这些miRNA在疾病发生发展中的作用，将有助于我们对疾病的认知，并为疾病的治疗提供新的治疗思路及靶点。

1材料与方法

1.1细胞及主要材料来源

实验用H9C2大鼠心肌细胞株，购自中国医学科学院细胞库。H-DMEM 培养基购自Invitrogen公司； 胎牛血清购自美国Hyclone公司；TNF-α 购于美国Epitomics公司；AKT抗体、Ser473磷酸化AKT抗体、GSK抗体、Ser9磷酸化 GSK抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；二抗(HRP标记的羊抗兔)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。miR-291b-3p 过表达腺病毒载体(AD-291b-3p mimic)构建与纯化交由上海吉凯科技有限公司完成。肌/肝糖原检试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

1.2大鼠心肌细胞的培养

H9c2细胞用含10%胎牛血清的H-DMEM培养基于37 ℃、5%CO2培养箱内培养，每2天更换培养液一次，细胞达约80%-90%丰度时，用0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例接种于新培养瓶中传代或六孔板中用于实验。

1.3细胞模型的建立

将状态良好的细胞接种于6孔板中，随机分为4组:正常对照组，未进行处理；TNF-α处理组，10 ng/ml TNF-α处理24 h；miR-291b-3p 表达的对照组(NC 组)，miR-291b-3p 表达组(Ad-291m组)。

1.4miR-291b-3p表达检测

收集上述细胞模型，应用实时荧光定量PT-PCR检测。采用Trizol试剂提取细胞RNA，取1μgRNA逆转录 miRNA合成cDNAR，反转录产物采用SYBR Green荧光定量试剂盒和荧光定量PCR仪行PCR。PCR 反应完毕后分析产物融解曲线判断反应的特异性，采用△循环阈值(Ct)法处理结果，计算相对表达量即2-△△ct。引物设计如下：

引物名称反转录引物序列5’-3’miR-291b-3pGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACACAAACU6GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACAAATATG

引物名称PCR引物序列5’-3’miR-291b-3pGCAAAGTGCATCCATTTTGTTTGTU6GCGCTCGTGAAGCGTTCUniverseprimerGTGCAGGGTCCGAGGT

1.5观察miR-291b-3p水平变化对胰岛素抵抗的影响

应用AD-291b-3p mimic及其阴性对照，分别感染H9C2细胞48 h后，收集细胞，用TRIzol提取总RNA，用特异性microRNA 反转录引物反转录1 μg RNA；应用real time PCR检测miR-291b-3p水平；用细胞裂解液提取细胞总蛋白，Western blot检测p-AKT、AKT、p-GSK、GSK水平；按肌、肝糖原检试剂盒说明操作，检测心肌细胞中糖原水平。

1.6统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件，采用t检验和单因素方差分析进行数据处理。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1TNF-α上调H9C2细胞中miR-291b-3p的表达水平，引起心肌胰岛素抵抗

10 ng/ml TNF-α处理H9C2细胞24 h，构建心肌胰岛素抵抗模型。根据Real time PCR检测结果显示，与对照组相比，TNF-α处理组中miR-291b-3p表达水平(图1A)升高2.8倍左右。同时，western blot的结果显示，TNF-α处理组中，AKT和GSK的磷酸化水平降低(图1C)，糖原水平明显升高(图1B)。上述结果提示，TNF-α 能够抑制胰岛素信号活性，引起H9C2细胞胰岛素抵抗；miR-291b-3p可能参与其中。

A.miR-291b-3p的表达水平；B.糖原水平；C.western blot检测AKT/GSK通路的蛋白水平(n=3,*P<0.5,**<0.01)

图1TNF-α处理H9C2细胞引起胰岛素抵抗

2.2过表达miR-291b-3p 抑制细胞AKT/GSK 信号通路活性

在H9C2细胞中，我们用AD-291b-3p mimics腺病毒感染H9C2细胞 48 h。结果显示miR-291b-3p表达水平明显升高(图2A)，AKT和GSK磷酸化水平降低，细胞中糖原水平显著升高(图2B，C)。由此可见，过表达miR-291b-3p能够抑制AKT/GSK信号通路活性，引起胰岛素抵抗。

A.miR-291b-3p的表达水平；B.糖原合成水平；C.western blot检测AKT/GSK通路的蛋白水平(n=3,*P<0.5,**<0.01，***<0.001)

3讨论

胰岛素抵抗是指机体对胰岛素的敏感性和反应性下降，导致正常量的胰岛素产生的生物学效应低于正常水平，可表现为葡萄糖摄取减少、糖原合成能力下降[3]。胰岛素抵抗不仅是2型糖尿病的主要发病机制，也是心血管疾病发生的危险因素。据统计，在糖尿病患者患有心血管疾病的大约占50%，且大部分死于心血管相关疾病[4]。目前，研究者主要关注肝脏、骨骼肌和脂肪在全身胰岛素抵抗中的作用，对心肌细胞胰岛素抵抗研究尚少。

炎症因子是诱发胰岛素抵抗的重要因素[5]。在骨骼肌细胞中，TNF-α可通过抑制胰岛素刺激葡萄糖吸收时多种相关蛋白，诱发胰岛素抵抗，如胰岛素受体底物-1(IRS-1)和葡萄糖转运蛋Et4(GLUT4)。胰岛素主要通过激活 PI3K信号通路[6]促进心肌细胞内 GLUT-2及 GLUT-4 表达增加而使心肌细胞葡糖摄取增加[7]。本研究发现，TNF-α处理能够降低H9C2细胞中AKT/GSK信号通路活性，升高细胞中糖原水平。说明TNF-α能够导致心肌细胞发生胰岛素抵抗。同时，TNF-α能够降低miR-291b-3p表达水平。提示，miR-291b-3p可能参与TNF-α引起的心肌细胞胰岛素抵抗。目前，越来越多的研究表明miRNA 能够广泛参与到胰岛素信号通路的调控以及葡萄糖稳态的调控中[2]。例如，miR-122[8]、miR-103和 miR-107[9]均参与调节机体胰岛素敏感性及糖脂代谢稳态。miR-291b-3p[10]属于miR-290家族，已有研究证实其参与肝脏胰岛素抵抗的AKT/GSK信号通路，该家族包括miR-290-3p、miR-291a-3p、miR-291b-3p、miR-292-3p、miR-291b-5p、miR-294以及miR-295，位于染色体7上的2200 bp的碱基片段，可以调控各种细胞信号通路[11]。在本研究中，我们发现在H9C2细胞中过表达miR-291b-3p能够抑制AKT/GSK信号通路活性，升高细胞糖原水平。说明miR-291b-3p能够调节H9C2细胞发生胰岛素信号敏感性,其作用与TNF-α一致。

综上所述，过表达 miR-291b-3p，可抑制AKT/GSK信号通路活性，降低细胞中糖原合成水平。由于miRNA具有特定基因调节的重要功能，有希望为临床疾病的诊断及治疗提供靶点。但是，今后我们还需进一步探讨miR-291b-3p调控胰岛素信号通路的分子机制及其下游靶基因。

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MiR-291b-3p regulates activation of insulin signal pathway in H9C2 cellSUIXiao-fang1,LIXue-jie2,WANGFeng-ling1,etal.(1.DepartmentofGeriatrics,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity；2.Geriatrics,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Postgraduatestudent,Jiamusi154002，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effecte of miRNA-291b-3p on the insulin resistance in H9C2 cells.Methods①H9C2 cells were treated with 10 ng/ml TNF-α for 24 h to induce insulin resistance.And the level of miR-291b-3p,activation of AKT/GSK pathway and the level of glycogen were analyzed.②In order to over-express miR-291b-3p,H9C2 was infected with AD-291b-3p mimices for 48 h.And the level of miR-291b-3p,activation of AKT/GSK pathway and the level of glycogen were analyzed.Results①TNF-α treatment significantly up-regulated miR-291b-3p expression and glycogen level,accompanied by decreased activation of AKT/GSK pathway.②In H9C2 cells Infected with AD-miR-291b-3p mimics,the levels of miR-291b-3p and glycogen level were increased and activation of AKT/GSK pathway was inhibited.ConclusionIn H9C2 clls,TNF-α treatment or over-expression of miR-291b-3p inhibited activation of AKT/GSK pathway.

Key words:Myocardial cell,insulin resistance,miR-291b-3p,TNF-α

(收稿日期：2015-11-20)

作者简介：隋小芳(1976-)，女，副主任医师，硕士研究生导师，主要从事老年心血管疾病的临床与基础研究；王凤玲，女(1963-)，教授，硕士研究生导师，主要从事动脉硬化的临床与基础研究。

文献标识码：A

中图分类号：Q786

文章编号：1007-4287(2016)02-0182-04

*通讯作者

基金项目:黑龙江省自然基金面上项目(项目编号：H2015076)；黑龙江省中医药中青年科技攻关项目(项目编号：ZQG-055)；佳木斯大学研究生科技创新项目(项目编号：LM2015_013)