液相色谱串联质谱法同时测定化妆品中溴甲酚绿与溴百里酚蓝

符策奕，梁颖，许文佳，陈朝曼

(海南省药品检验所化妆品室，海南海口570216)

液相色谱串联质谱法同时测定化妆品中溴甲酚绿与溴百里酚蓝

符策奕，梁颖，许文佳，陈朝曼

(海南省药品检验所化妆品室，海南海口570216)

目的建立液相色谱串联质谱同时测定化妆品中溴甲酚绿与溴百里酚蓝的定性、定量方法。方法样品经甲醇超声提取，HLB固相萃取柱分离，再通过C18色谱柱(Kinetex C18 2.6 μm 100A100×2.10 mm)分离，采用电喷雾离子源及多反应监测模式(MRM)对目标化合物进行测定。结果溴甲酚绿与溴百里酚蓝的方法检出限分别是0.82 mg/kg、0.84 mg/kg。溴甲酚绿与溴百里酚蓝的线性范围均为0.02～4 μg/mL，相关系数均大于0.999 5(rBG= 1.000 0，rBB=0.999 9)，在不同剂型的化妆品中平均回收率在98.0%～109%范围内。结论该方法具有前处理简单，结果准确等特点，适用于化妆品中溴甲酚绿与溴百里酚蓝的测定。

液相色谱串联质谱；化妆品；溴甲酚绿；溴百里酚蓝

随着近年来人民生活水平的不断提高，化妆品也逐步走进千家万户，但化妆品带来的过敏性疾病数量也在不断增加，这已成为过敏性皮炎的主要来源之一[1-3]。为了带给消费者更好的感官效果，化妆品中往往添加各种着色剂，而禁限着色剂滥用的情况同样存在[4-5]。溴甲酚绿与溴百里酚蓝属于具有刺激性的着色剂，溴甲酚绿(Xi)属于R36类化学品，即具有刺激眼睛系统功能；溴百里酚蓝属于S24/25类化学品，应避免眼睛和皮肤接触。在我国卫生部颁发的《化妆品卫生规范》2007年版与欧盟化妆品检测指导书(No：1223/ 2009)中规定溴甲酚绿与溴百里酚蓝专用于仅和皮肤暂时接触的化妆品(Rinse-off product)[6-7]。目前我国尚未建立化妆品中溴甲酚绿与溴百里酚蓝的检测方法，因此市面上的产品是否添加了上述限用的着色剂无法获得准确的评价[8-11]。

本文拟建立一种适用于化妆品的溴甲酚绿与溴百里酚蓝检测方法以监测上述着色剂在化妆品中的使用情况，为上述限用物质的监督检查提供必要依据。为了保证新建方法不受到各种原辅料的干扰，提高方法的专属性，本文采用固相萃取柱与液相色谱-质谱联用仪相结合的方式对多种不同类型的基质样品进行分析。

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器设备Thermo U3000液相色谱串联AB APΙ4000+质谱仪；色谱柱:Phenomenex Kinetex C18 2.6 μm，100 A，100×2.10 mm；Mili-Q超纯水器(Millipore)；电子分析天平(Mettler Toledo AL204)；超声波提取仪(KUDOS SK8210LHC)。

1.1.2 试剂与耗材乙腈(LC-MS级，Merk)、甲醇(LC-MS级，Merk)、甲酸(色谱级，TEDΙA)、水(超纯水，电阻率为18.2 MΩ·cm)、HLB固相萃取柱(60 mg，3 mL，Oasis)。

1.1.3 标准品与标准溶液配制溴甲酚绿(Bromocresol green，sigma，以干品计含量为95.4%)、溴百里酚蓝(Bromothymol Blue，sigma，以干品计含量为95%)。取溴甲酚绿与溴百里酚蓝标准品适量，用甲醇溶解稀释成含量约2 mg/mL的标准品单标储备液。再用甲醇配制成溴甲酚绿与溴百里酚蓝浓度分别为202.1 μg/mL、207.5 μg/mL的混合标准品储备液，于-20℃保存。

1.2 前处理方法精密称取样品约0.5 g，置25 mL比色管中加甲醇20 mL，振荡涡旋1 min，使样品与溶剂充分混匀，超声提取20 min后放冷至室温再用甲醇定容至刻度，混匀后精密量取上述样品液1 mL置活化好的HLB固相萃取柱中，以1滴/2s的速度过柱，再用甲醇3 mL分3次洗涤固相萃取柱，抽干。收集从上样到抽干全过程的洗脱液，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀，即得样品供试液。HLB柱使用前分别依次用5 mL甲醇、5 mL水、3 mL甲醇活化，并保持柱体湿润。

1.3 色谱条件与质谱条件

1.3.1 色谱条件色谱柱：KΙNETEX C18 2.6 μm，100 A，100×2.10 mm；柱温：35℃；流速：0.3 mL/min；流动相：A为0.1%甲酸甲醇，B为0.1%甲酸水；梯度洗脱：0～5 min，50%A；5～10 min，50%～85%A；10～15 min，85%A；15～16 min，85%～50%A；16～25 min，50%A。

1.3.2 质谱条件ESΙ为正离子模式扫描，多反应监测(MRM)，离子喷雾电压为4 500 V，离子源温度(TEM)550℃，帘气(CUR)15 psi，碰撞气(氮气)，雾化气(GS1)55 psi，辅助气(GS2)55 ps，分析目标化合物的去簇电压(DP)与碰撞能量(CE)值见表1、图1。

表1 溴甲酚绿与溴百里酚蓝的质谱分析条件

图1 溴甲酚绿与溴百里酚蓝混合标准溶液总离子流图

1.4 方法学实验

1.4.1 线性与检出限取混合标准品储备液适量，配制溴甲酚绿与溴百里酚蓝目标浓度在0.02～20 μg/mL之间的8个系列混合标准溶液并进行测定，以目标峰峰面积为y，质量浓度为x(μg/mL)，绘制标准曲线。将混合标准溶液稀释至各个化合物最低响应色谱峰信噪比(S/N)为3～4的浓度，再以此浓度折算方法检出限(LOD)。

1.4.2 加样回收率与精密度取空白的香水、护肤水、啫喱、洁面膏和粉底分别加入50 μL、100 μL、200 μL的混合标准品储备液，使低、中、高三个浓度的溴甲酚绿与溴百里酚蓝的添加量为约20 mg、40 mg、80 mg/kg，于暗处静置3 h后按上述前处理方法处理并进样分析。将回收率按液体、半固体、固体进行分类平均并计算每一类别中总的加标回收精密度(RSD%)。

1.4.3 实际样品检测选取从海南各市县市场上采购的各类样品共54批样品采用上述前处理方法处理并进样分析。实际样品涉及：香水、护肤水、花露水、美白乳膏、防晒霜、育发液、烫发液、脱毛膏、洗发水、洗面奶、面膜、粉底、眼影等类型产品。

2 结果

2.1 线性与检出限采用本方法测定化妆品中溴甲酚绿与溴百里酚蓝的方法检出限分别为0.82 mg/kg、0.84 mg/kg，可满足现行国家标准规定的检验要求，且线性相关系数均大于0.999 5，可用于定量测定。实际标准溶液在0.02～20 μg/mL范围内溴甲酚绿与溴百里酚蓝线性相关系数均大于0.999 7，但由于增加20 μg/mL浓度点后线性方程的截距均大于0.02 μg/mL浓度的色谱峰响应值，因此仅建立0.02～4 μg/mL的线性方程，见表2。

表2 溴甲酚绿与溴百里酚蓝的校准曲线、相关系数和检出限

2.2 加样回收率与精密度溴甲酚绿与溴百里酚蓝在三大类不同化妆品中平均添加回收率的范围是98.0%～109%，精密度(RSD%)值均小于6.0%，说明本方法具有较好的准确度与精密度，见表3。

表3 样品加标回收率实验结果

2.3 实际样品测试结果经测试共54批不同品牌规格的实际样品，结果未见有基质干扰情况，样品也均未检出溴甲酚绿与溴百里酚蓝。可见目前海南化妆品市场上并未出现溴甲酚绿与溴百里酚蓝大规模滥用情况。

2.4 前处理方法的选择实验考察了水、50%甲醇、甲醇、乙腈作为提取溶剂提取样品时的效果，结果甲醇效果最佳，且如果使用50%甲醇或水稀释样品供试液时，部分样品会因为辅料的析出而导致溴甲酚绿与溴百里酚蓝回收率显著降低。经实验考察，采用甲醇作为提取溶剂时，以洁面膏为基质本底超声提取20 min溴甲酚绿与溴百里酚蓝提取回收率效果最佳，延长时间非但不可提高提取效果，反而会导致回收率降低，见图2。为保护色谱柱性能，避免不溶物对色谱串联质谱分析稳定性的影响，样品前处理时拟采用有机膜过滤样品供试液。但溴甲酚绿与溴百里酚蓝经有机膜过滤后会导致回收率显著降低。经测试在0.16 μg/mL浓度时溴百里酚蓝用0.45 μm(尼6)有机滤膜弃去8 mL初滤液后回收率方达90%以上，但溴甲酚绿弃去8 mL初滤液质谱仪仍无任何响应，因此放弃使用有机膜过滤样品供试液的方案。考虑到有机滤膜过滤会导致目标化合物被吸附，离心对部分样品不适用，因此拟采用固相萃取技术纯化样品供试液后直接检测。经实验，当HLB固相萃取柱采用甲醇洗涤1 mL时，溴百里酚蓝回收率可达90%，溴甲酚绿回收率仅有35%，洗涤3 mL时两种组分回收率均在95%以上，因此选择甲醇洗涤3 mL为洗脱条件。

图2 不同超声时间提取回收率

2.5 质谱与色谱条件的选择经测试甲醇、乙腈、水、甲酸水、乙酸水、乙酸铵水的不同组合，结果0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水色谱体系色谱峰峰形、分离度相对较好。为了保证实验的重现性，色谱系统在16～25 min平衡色谱系统9 min。将浓度为20 μg/mL的溴甲酚绿与溴百里酚蓝通过蠕动泵与流动相分别注入质谱，确定特征离子与去簇电压、碰撞能量等关键参数。结果上述两种组分均在ESΙ(+)模式下获得具有较高响应的(M+H)+分子离子峰，因此本文选用ESΙ (+)为离子源电离模式，以(M+H)+为分子离子峰进行分析。虽然由于化学结构中溴元素的存在，这两种组分均有较高的同位素响应峰，但为了保证待测物的专属性，本文未选用同位素峰作为定性离子峰，而选择其他响应较强的碎片峰进行定性，本文选定的MRM离子对标准溶液谱图见图3。

图3 溴甲酚绿与溴百里酚蓝混合标准溶液提取离子色谱图

3 结论

建立了一种固相萃取结合液相色谱串联质谱仪检测化妆品中溴甲酚绿与溴百里酚蓝的方法，并采用该方法对5类不同剂型的香水、护肤水、洁面膏、啫喱和粉底等产品进行加标实验和54批从海南各市县采集的不同来源实际样品测试实验。结果加标实验平均回收率达到98.0%～109%。实际样品测试结果均未检出溴甲酚绿与溴百里酚蓝，可见目前海南化妆品市场上尚未出现大规模违禁添加溴甲酚绿与溴百里酚蓝的情况。

综上所述，本研究建立了一种前处理简单，检测速度快，专属性强，基质干扰低，具有很强实用性的溴甲酚绿与溴百里酚蓝检测方法，为针对上述化合物在化妆品中滥用情况的监督检查提供可靠的检验依据。

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Simultaneous determination of bromocresol green and bromothymol blue in cosmetics by high performanceliquid chromatography tandem mass spectrometry.

FU Ce-yi,LIANG Ying,XU Wen-jia,CHEN Chao-man. Laboratory of Cosmetics,Hainan Provincial Institute for Drug Control,Haikou 570216,Hainan,CHINA

ObjectiveTo develop the high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric method for the simultaneous determination of bromocresol green(BCG)and bromothymol blue(BTB)in cosmetics. MethodsThe cosmetic sample was extracted with methanol under ultrasonication,and separated by HLB solid phase extraction.The extracted complexes were separated on a C18 column(Kinetex C18,2.6 μm,100 A,100×2.10 mm),and identified under electrospray ionization and multiple reactions monitoring(MRM)mode.ResultsThe LODs of BCG and BTB are respectively 0.82 mg/kg and 0.84 mg/kg.Calibration curves were linear in the range of 0.02～4 μg/mL for BCG and BTB,with the correlation coefficients greater than 0.999 5(rBG=1.000 0,rBB=0.999 9).The average recoveries of BCG and BTB in different dosage forms of cosmetics ranged from 98.0%to 109%.ConclusionThe method is simple sensitive and accurate,which adapts to simultaneous determination of BCG and BTB in cosmetics.

HPLC-MS/MS;Cosmetics;Bromocresol green(BCG);Bromothymol blue(BTB)

R446

A

1003—6350（2016）13—2150—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.13.030

2016-01-21)

符策奕。E-mail：xf_vicar@126.com。