海南三叉苦抗炎作用及机制研究

林紫微，赵智萍，林志军，王海龙，任守忠，李佩佩

（海南医学院药学院，海南海口571199）

海南三叉苦抗炎作用及机制研究

林紫微，赵智萍，林志军，王海龙，任守忠，李佩佩

（海南医学院药学院，海南海口571199）

目的研究海南三叉苦水提物的抗炎作用并探索其作用机制。方法通过二甲苯致小鼠耳肿胀、角叉菜胶致大鼠足肿胀来观察三叉苦的抗炎作用。采用酶联免疫吸附法(ELΙSA法)测定肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(ΙL-1β)的含量。结果与模型组(0)相比，三叉苦水提物中、高剂量(19.11%，22.94%)能抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀(P＜0.05)，中剂量对角叉菜胶致大鼠足肿胀有明显的抑制作用，在致炎4 h[(0.53±0.17)cm]效果最明显(P＜0.01)。水提物中、高剂量对大鼠血清中TNF-α[(169.61±73.80)ng/L和(124.34±85.65)ng/L]和ΙL-1β [(521.01±206.89)ng/L和(393.99±197.61)ng/L]有不同程度的降低作用，TNF-α较模型组[(283.98±68.68)ng/L]降低显著(P＜0.05)。结论海南三叉苦水提物具有抗炎作用，其抗炎作用可能与抑制TNF-α和ΙL-1β的生成有关。

三叉苦；抗炎；作用机制；肿瘤坏死因子α；白细胞介素1β

三叉苦为芸香科吴茱萸属植物三叉苦[Evodia lepta(Spreng.)Merr]的干燥全株，又名三桠苦、小黄散、鸡骨树、三丫苦、三枝枪、三叉虎等，味苦，性寒，具有清热解毒、祛风除湿、消肿止痛等功效；主治咽喉肿痛、疟疾、黄疸型肝炎、风湿骨痛、湿疹皮炎、感冒发热、扁桃体炎、咽喉炎、跌打肿痛、风湿痹痛等[1-3]。由三叉苦等组成的贯黄感冒冲剂等复方具有清热解毒、祛风止咳作用，用于感冒、发热、咳嗽等风热型感冒，在市场上具有较好的声誉。本实验通过研究海南三叉苦对两种急性炎症模型的保护作用，比较海南三叉苦水提物对正常和炎症模型大鼠血清中的TNF-α和ΙL-1β含量的影响，进一步探讨其抗炎作用机制，以便为开发海南三叉苦的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物50只健康昆明种小鼠和48只健康昆明种大鼠，购于长沙市天勤生物科技有限公司。

1.2 仪器TP-1200C公斤电子天平(湘仪天平仪器设备有限公司)；SENCO R系列旋转蒸发器(上海申生科技有限公司)；SENCO W201恒温水浴锅(上海申生科技有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；HH-6数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)；MK3酶标仪(美国Thermo)。

1.3 药材与试剂三叉苦采于海南省琼海市长坡镇，经海南医学院曾念开老师鉴定为芸香科吴茱萸属植物三叉苦的干燥茎叶；阿司匹林肠溶片(批号：150116222，辰欣药业股份有限公司)；布洛芬缓释胶囊(批号：20150505，长春海外制药集团有限公司)；二甲苯(批号：20140919，广州光华科技股份有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 海南三叉苦水提物样品制备水煎煮法制备，称取三叉苦干燥茎叶共2 000 g，浸泡过夜，煎煮3次。第一次10倍量水煎煮2 h，第二次9倍量水煎煮1.5 h，第三次8倍量水煎煮1 h，过滤，合并滤液，减压浓缩至稠膏，50℃下真空干燥，计算提取率。实验时用蒸馏水溶解至所需浓度。

1.4.2 海南三叉苦水提物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响[4]取小鼠50只，称重，标号，按体重随机分为5组，即模型组、阿司匹林组、三叉苦水提物低、中、高剂量组，每组10只。灌胃给药，连续给药5 d，1次/d，灌胃体积为0.1 mL/10 g体重，模型组给予等体积的蒸馏水。末次给药后1 h，在每只小鼠右耳前后两面涂二甲苯各20µL，左耳不涂作为对照，45 min后脱颈处死，剪下完整左右耳，用6 mm直径打孔器在距耳缘1 cm处打下圆耳片，称重。左右耳的重量之差作为肿胀度并计算肿胀抑制率，计算公式为：肿胀度=右耳重量-左耳重量，肿胀抑制率=(模型组肿胀度－药物组肿胀度)/模型组肿胀度×100%。

1.4.3 海南三叉苦水提物对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响[5]取大鼠42只，按1.4.1方法分为6组，即空白组、模型组、布洛芬组、三叉苦水提物低、中、高剂量组，每组8只。灌胃给药，连续5 d，1次/d，灌胃体积为1 mL/100 g体重，空白组和模型组给予等体积蒸馏水。末次给药后，测量每只大鼠右后足踝关节周长(cm)，1 h后，除空白组以外，每组大鼠均在右后足足趾中部皮下注射1%角叉菜胶0.1 mL/只致炎。分别在致炎后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h测定大鼠右后足踝关节周长，计算足趾肿胀度，即足趾肿胀度=致炎后踝关节周长-致炎前踝关节周长。致炎后6 h，乙醚麻醉，断头取血，备用。

1.4.4 大鼠血清中TNF-α和ΙL-1β的含量取1.4.3法中大鼠断头所得全血，于3 600 r/min下离心，吸取上清液即得到血清。用酶联免疫吸除法(ELΙSA)，严格按照试剂盒说明书操作，测定大鼠血清中TNF-α和ΙL-1β的含量。

1.5 统计学方法采用SPSS16.0软件进行分析，计量数据用均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用t检验，显著性水平α界定值设定为0.05。以P＜0.05为差异具有统计学的意义。

2 结果

2.1 海南三叉苦水提物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响与模型组比较，三叉苦水提物中、高剂量组对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制较明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)，而三叉苦水提物低剂量组差异无统计学意义。三叉苦不同剂量组之间有一定的量效关系，高、中剂量组与低剂量组之间有明显的量效关系，而中、高剂量组之间的量效关系不明显，见表1。

表1 海南三叉苦水提物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响(±s)

表1 海南三叉苦水提物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响(±s)

注：与模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01。

组别剂量(g/kg)耳肿胀度(mg)肿胀抑制率(%)模型组阿司匹林组三叉苦-0.5 18 6 2 4.97±0.59 3.03±1.39b3.83±1.39a4.02±0.94a4.38±0.59 0 39.64 22.94 19.11 11.87

2.2 海南三叉苦水提物对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响由表2可知，与模型组比较，致炎后1 h、2 h、4 h、5 h、6 h，三叉苦中剂量组的大鼠足肿胀度显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；致炎后4 h、5 h，高剂量组足肿胀度显著降低，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；致炎后4 h，低剂量组足肿胀度降低显著，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

表2 海南三叉苦水提物对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响(±s)

表2 海南三叉苦水提物对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响(±s)

注：与模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01。

组别剂量（g/kg）足肿胀度(cm)模型组布洛芬组三叉苦-0.09 13.5 4.5 1.5 1 h 0.50±0.34 0.23±0.14 0.40±0.35 0.16±0.16a0.39±0.26 2 h 0.86±0.55 0.33±0.14a0.71±0.39 0.44±0.25a0.90±0.33 3 h 0.99±0.35 0.46±0.22b0.63±0.45 0.67±0.21 0.75±0.19 4 h 1.10±0.27 0.37±0.23b0.59±0.37a0.53±0.17b0.78±0.19a5 h 0.93±0.17 0.34±0.22b0.51±0.34a0.46±0.34b0.69±0.15 6 h 0.89±0.38 0.33±0.15b0.63±0.21 0.39±0.27a0.59±0.24

2.3 大鼠血清中TNF-α和ΙL-1β的含量三叉苦水提物中、高剂量组均能降低TNF-α的含量，且与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；三叉苦水提物各剂量组能不同程度地降低ΙL-1β的含量，但差异无统计学意义，见表3。

表3 海南三叉苦水提物对角叉菜胶所致足肿胀大鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的影响(±s)

表3 海南三叉苦水提物对角叉菜胶所致足肿胀大鼠血清中TNF-α和IL-1β含量的影响(±s)

注：与模型组比较，aP＜0.05，bP＜0.01。

组别空白组模型组布洛芬组三叉苦剂量(g/kg) --0.09 13.5 4.5 1.5 TNF-α(ng/L) 133.97±51.64b283.98±68.68 198.26±66.51a124.34±85.65b169.61±73.80a211.78±43.33 ΙL-1β(ng/L) 383.39±232.27a565.88±202.14 562.84±214.19 393.99±197.61 521.01±206.89 571.97±223.47

3 讨论

本实验通过复制二甲苯致小鼠耳肿胀、角叉菜胶致大鼠足肿胀两种急性炎症模型，观察三叉苦水提物抗炎效果。结果表明，三叉苦水提物对角叉菜胶致大鼠足肿胀有抑制作用，且三叉苦水提物中剂量组对足肿胀的抑制效果明显。可见海南三叉苦水提物有明显的抗炎作用。

炎症过程中释放的炎性介质是造成机体损害的重要原因，TNF-α是炎性细胞因子，参与全身炎症反应，是一种内源性致热源，能够引起发烧，诱导细胞凋亡，TNF-α与内皮细胞结合可增加过氧化物阴离子产生，刺激细胞脱颗粒和髓过氧化物酶，从而使内皮细胞分泌ΙL-8、ΙL-1和GM-CSF等炎性因子增加，并促进中性粒细胞在内皮细胞上黏附，进而刺激机体局部发生炎症反应，是一个重要的炎症介质[6]。ΙL-1β是由活化的单核巨噬细胞产生的炎性因子，能调节炎症反应中纤维蛋白的沉积和溶解，促进成纤维细胞胶原酶的产生，刺激成纤维细胞增殖，促进胶原沉积，参与机体的炎症反应过程[7]。三叉苦水提物给药组大鼠血清中TNF-α和ΙL-1β的含量与模型组比较有不同程度的降低，其中TNF-α下降明显，差异有统计学意义，ΙL-1β虽有一定程度降低，但差异无统计学意义，提示抑制TNF-α和ΙL-1β的生成可能是三叉苦抗炎的作用机制。且其抑制作用具有明显的量效关系，在一定的范围内，TNF-α和ΙL-1β的含量随着给药剂量的增加而显著降低。

从小鼠耳肿胀实验结果来看，海南三叉苦水提物的抗炎效果次于阿司匹林；从大鼠足肿胀以及血清中TNF-α、ΙL-1β的测定实验结果来看，海南三叉苦水提物的抗炎效果优于布洛芬。由此可见，海南三叉苦具有良好的抗炎作用。据调查，一些海南人民会用三叉苦叶子泡茶，有药食同源之功。因此，海南三叉苦具有很高的药用商品化价值，可以被进一步的开发利用。

[1]国家中医药管理局编委会.中华本草:第二十九卷第四分册[M].上海:上海科学技术出版社,1999:915.

[2]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社,2003: 68.

[3]中医学编辑委员会.中国医学百科全书:中医学中册[M].上海:上海科学技术出版社,1991:1030.

[4]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,1992:719．

[5]徐叔云.药理实验方法学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2002: 882.

[6]赵玮,徐景杰.肿瘤坏死因子-α在炎症与肿瘤中的作用[J].中国疗养医学,2012,21(7):607-609.

[7]俞浩,方艳夕,毛斌斌,等.地榆炮制前后水提物抗炎效果研究[J].中药材,2014,37(1):34-37.

Anti-inflammatory effect and mechanism of Evodia lepta in Hainan.

LIN Zi-wei,ZHAO Zhi-ping,LIN Zhi-jun,WANG Hai-long,REN Shou-zhong,LI Pei-pei.School of Pharmacy,Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the anti-inflammatory effect and mechanism of Evodia lepta in Hainan. MethodsThe anti-inflammatory effect of Evodia lepta was observed by acute inflammation model of the mouse ear swelling and rat foot swelling.The contents of tumor necrosis factor alpha(TNF-α)and interleukin 1 beta(ΙL-1β) were determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELΙSA).ResultsCompared with the model group,the middle and high dose water extracts(19.11%,22.94%,respectively)of Evodia lepta could inhibit the ear swelling induced by xylene(P＜0.05);The water extracts at middle doses could remarkably restrained paw edema induced by carrageen,with the best anti-inflammatory effect at 4 h[(0.53±0.17)cm,P＜0.01];The water extracts at middle and high dose could reduce the content of TNF-α[(169.61±73.80)ng/L vs(124.34±85.65)ng/L]and ΙL-1β[(521.01±206.89) ng/L vs(393.99±197.61)ng/L]in rat serum;Compared with the model group[(283.98±68.68)ng/L],the TNF-α was decreased significantly(P＜0.05).ConclusionThe water extract of Evodia lepta has anti-inflammatory effect,and its anti-inflammatory effect may be related to inhibiting the formation of TNF-α and ΙL-1β.

Evodia lepta(Spreng.)Merr.;Anti-inflammatory;Mechanism;Tumor necrosis factor alpha (TNF-α);Ιnterleukin 1 beta(ΙL-1β)

R285.1

A

1003—6350（2016）13—2079—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.13.005

2016-02-25)

2014年省级大学生创新创业训练计划项目（编号：20140112）

任守忠。E-mail：540877323@qq.com