天麻素对大鼠离体胸主动脉血管环的作用及机制研究
2016-03-06钟节雄杨宏华
钟节雄,杨宏华
(武汉市商业职工医院心血管内科,湖北武汉430000)
天麻素对大鼠离体胸主动脉血管环的作用及机制研究
钟节雄,杨宏华
(武汉市商业职工医院心血管内科,湖北武汉430000)
目的观察天麻素对大鼠离体胸主动脉环的作用,并探讨其作用机制。方法采用离体动脉环灌流方法,观察累加浓度天麻素对大鼠离体胸主动脉环的直接作用;同法观察不同浓度天麻素(5 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L)对10-6mol/L去氧肾上腺素(PE)预收缩有内皮和去内皮血管环的作用;用无Ca2+K-H液和不同浓度天麻素孵育对PE收缩去内皮血管环的作用;观察200 μmol/L天麻素对60 mmol/L KCl预收缩血管环的作用。结果天麻素直接作用于血管环时,天麻素组与对照组血管紧张度比较差异无统计学意义(P>0.05);天麻素(≥50 μmol/L)作用于PE预收缩血管环时,有内皮天麻素组血管环舒张率分别高于有内皮对照组[(41.9±8.9)%、(57.6±9.1)%、(65.0±10.2)%、(75.6±11.7)%、(81.9±12.0)%vs(10.5±1.6)%、(19.4±5.9)%、(22.6±7.2)%、(24.9±6.8)%、(25.1±7.3)%、P<0.05],去内皮天麻素组血管环舒张率分别高于去内皮对照组[(20.6±2.9)%、(36.5±8.2)%、(43.7±9.3)%、(55.7±9.6)%、(58.7±9.6)%vs(9.8±2.1)%、(15.8±4.7)%、(18.6±6.5)%、(20.3±5.0)%、(21.5±5.1)%,P<0.05],且均有浓度依赖性,多组间比较F值分别为5.67,5.99,6.11,6.47,7.05,P<0.05;天麻素作用于无钙K-H液中PE收缩去内皮血管环时,实验组舒张率[(5.1±1.2)%]小于对照组[(12.8±3.7)%],差异有统计学意义(t=5.599,P<0.05)。天麻素处理作用于60 mmol/L KCl预收缩的血管环时,天麻素组[(96.7±8.6)%]与对照组[(98.6±7.9)%]张力变化差异无统计学意义(t=0.581,P>0.05)。结论天麻素对正常血管无舒张作用;天麻素能舒张PE预收缩的血管,其机制是通过抑制血管平滑肌ΙP3受体介导的内钙释放;它不能抑制α1受体依赖性钙通道和电压依赖性钙通道;天麻素舒张PE收缩的血管的作用有内皮依赖性和浓度剂量依赖效应。
大鼠;天麻素;胸主动脉环;作用;机制
天麻是一种名贵的中药,在亚洲地区已经被应用于治疗各种疾病,历史悠久,长达几千年,目前未发现其对人体有明显副作用[1]。天麻素(羟甲基苯-β-D吡喃葡萄糖苷)是从天麻中提取的最有效活性成分[2],它能增加脑血流量,改善大脑基底动脉等供血不足[3];能够改善大脑及心脏缺血再灌注损伤[4]。天麻素注射液已广泛应用于临床,能有效治疗颈动脉供血不足的眩晕[5]。目前已知天麻素是通过改善动脉的供血状况而发挥临床作用,但其具体机制尚不清楚。本实验拟采用离体大鼠胸主动脉环灌流模型,实时测量血管环张力,观察天麻素对离体大鼠胸主动脉环静息张力的影响,探讨天麻素对胸主动脉血管的作用及其可能的机制,为临床应用提供更充足的理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器天麻素(Gastrodin)购自中国食品药品检定研究院;盐酸去氧肾上腺素(PE)购自上海禾丰制药有限公司;氯乙酰胆碱(Ach)购自上海化学试剂总厂;EGTA购自Amresco公司。其他试剂均为国产分析纯,购自武汉华联科生物有限公司。Kreb-Henseleit (K-H)液配置[4]:NaCl 118 mmol/L,KCl 4.7 mmol/L,NaHCO325 mmol/L,KH2PO41.2 mmol/L,MgCl21.2 mmol/L,CaCl22.5 mmol/L,Glucose 11.1 mmol/L,pH 7.4。无钙K-H液中含0.05 mmol/L EGTA,不含CaCl2,其他成分同K-H液。离体组织灌流仪为Power-Lab/4P生物信号记录分析系统(澳大利亚AD Ιnstruments)。
1.2 实验动物湖北省实验动物研究中心提供Wistar大鼠(260~300 g),许可证号:SCXK(鄂)2008-0005,共30只,雌雄各半。
1.3 血管环制备动物实验经本单位实验动物伦理委员会批准。断颈处死大鼠,游离出胸主动脉,置于95%O2和5%CO2混合气饱和的4℃K-H液中剥离血管周围结缔组织,剪成2.0~3.0 mm长的血管环,每只鼠取四段(不同组内血管环来自不同大鼠),将血管环置于盛有10 mL持续通入混合气体的37℃K-H液的浴槽中。血管环在基础状态下稳定15 min后分次加到2 g静息张力平衡1.5 h,期间每15 min换一次液。用60 mmol/L KCl或10-6mol/L PE刺激血管环使血管环收缩,达到最大收缩幅度后冲洗3次,使血管环恢复到刺激前的状态,重复2次,以诱发血管最大收缩幅度。检验内皮完整性[5]:用10-6mol/L PE刺激血管环,达到最大收缩幅度后加入10-5mol/LAch待稳定后测定张力并计算血管舒张率,舒张率<10%表示完全去内皮,为去内皮组,舒张率>80%表示内皮完整,为有内皮组,否则弃用。检测去内皮效果后冲洗血管环恢复至刺激前状态,稳定30 min,期间每15 min换一次液,再进行后续实验操作。
1.4 天麻素直接作用于完整内皮血管环取制备好的完整内皮离体胸主动脉环12只,随机平均分为天麻素组和对照组,每组6只,天麻素组中,在K-H液中累加入浓度为5 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L的天麻素,直接作用于离体血管环,对照组用等量K-H液代替每次累加的天麻素,实时观察大鼠胸主动脉环的张力变化,用紧张度表示(紧张度=加药后张力/加药前张力×100%)。
1.5 天麻素作用于PE预收缩血管环取完整内皮血管环32只,随机分为实验组和天麻素组两组,每组16只,将两组中的血管环分别又随机选择8血管环进行去内皮处理,最后形成四组分组:由内皮对照组、无内皮对照组、有内皮天麻素组和无内皮天麻素组,每组8个血管环。用10-6mol/L浓度的PE预处理所有血管环,待达到收缩峰值并稳定后,实验组累加浓度为5 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L的天麻素,对照组用等量K-H液代替。观察四组血管环每次加药前后的张力变化,计算每个天麻素浓度点的舒张率[舒张率=(加药前张力-加药后张力)/PE收缩张力值×100%],并制作天麻素对血管环作用的量效曲线。
1.6 天麻素作用于无钙K-H液中PE收缩去内皮血管环取去内皮血管环16只,随机分为对照组和实验组,每组各8只,两组血管均用K-H液稳定血管环1.5 h后用无钙K-H液冲洗血管环两次,每间隔15 min换一次液,待稳定30 min后实验组加200 μmol/L天麻素,对照组加入等量的K-H液,孵育30 min后再加入10-6mol/L PE,观察血管环收缩幅度;随后,实验组再加入3 mmol/L CaCl2,观察对血管环作用,对照组用等量K-H液代替。比较实验组与对照组PE及CaCl2对血管环的收缩率,收缩率=(加药后张力-加药前张力)/加药前张力×100%。
1.7 天麻素作用于KCl预收缩去内皮血管环取去内皮血管环12只,随机分为实验组和对照组,每组6只,在所有血管环的K-H液中加60 mmol/L KCl预收缩胸主动脉环,当达到收缩峰值后,实验组加200 μmol/L的天麻素,对照组用等量K-H液代替,观察加药前后血管环张力变化,用紧张度表示。
1.8 统计学方法应用SPSS17.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间两两比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 天麻素对完整内皮血管环的直接作用用初始浓度5 μmol/L天麻素作用于完整内皮血管环时,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),当浓度分别增加至50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L和250 μmol/L时,天麻素血管紧张度与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。
2.2 不同浓度天麻素对PE预收缩血管环的作用用PE预收缩血管后,添加天麻素浓度为初始浓度5 μmol/L时,各组间的舒张率差异无统计学意义;当天麻素浓度增加为50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L、250 μmol/L时,F检验结果显示有内皮天麻素组、去内皮天麻素组、有内皮对照组和去内皮对照组等多组间比较差异有统计学意义,且有内皮天麻素组血管环舒张率分别高于有内皮对照组;去内皮天麻素组血管环舒张率分别高于去内皮对照组(P<0.05);去内皮天麻素组血管环舒张率分别高于去内皮天麻素组(P<0.05)。这提示天麻素对血管环作用有内皮依赖性。随天麻素浓度增加,血管舒张率增加,提示天麻素对PE预收缩的血管环作用与天麻素浓度呈现量效曲线关系,见表2。
表1 天麻素对完整内皮血管环直接作用的紧张度比较(±s,%)
表1 天麻素对完整内皮血管环直接作用的紧张度比较(±s,%)
组别天麻素累积浓度(μmol/L) 550100150200250天麻素组(n=6)对照组(n=6) t值P值98.6±7.3 96.9±8.8 0.364>0.05 95.2±5.6 96.7±6.8 0.319>0.05 94.9±5.8 93.6±7.2 0.269>0.05 92.5±6.4 95.8±6.8 0.278>0.05 95.3±8.6 92.8±6.9 0.356>0.05 94.7±7.3 96.0±6.2 0.318>0.05
表2 累加浓度天麻素对PE预收缩血管环的作用(±s,%)
表2 累加浓度天麻素对PE预收缩血管环的作用(±s,%)
注:与有内皮对照组比较,aP<0.05;与去内皮对照组比较,bP<0.05;与去内皮天麻素组比较,cP<0.05。
组别天麻素累积浓度(μmol/L)有内皮天麻素组(n=8)去内皮天麻素组(n=8)有内皮对照组(n=8)去内皮对照组(n=8) F值P值250 81.9±12.0ac58.7±9.6b25.1±7.3 21.5±5.1 7.05 0.019 5 8.9±2.6 7.4±3.7 6.2±3.8 7.0±2.5 3.92 0.183 50 41.9±8.9ac20.6±2.9b10.5±1.6 9.8±2.1 5.67 0.036 100 57.6±9.1ac36.5±8.2b19.4±5.9 15.8±4.7 5.99 0.033 150 65.0±10.2ac43.7±9.3b22.6±7.2 18.6±6.5 6.11 0.028 200 75.6±11.7ac55.7±9.6b24.9±6.8 20.3±5.0 6.47 0.024
2.3 天麻素对无钙K-H液中PE收缩去内皮血管环的作用加PE处理天麻素孵育的血管环(PE实验组,n=8)和无天麻素孵育的血管环(PE对照组,n=8),PE实验组[(5.1±1.2)%]收缩率显著小于PE对照组[(12.8±3.7)%],差异有统计学意义(t=5.599,P<0.05);但当用CaCl2处理时,PE实验组收缩率为(55.1±6.2)%,与PE对照组的(52.8±9.7)%比较差异无统计学意义(t= 0.581,P>0.05)。
2.4 天麻素对KCl预收缩去内皮血管环作用用60 mmol/L KCl预收缩胸主动脉环,当达到收缩峰值后实验组加200 μmol/L的天麻素,对照组用等量K-H液代替,实验组[(96.7±8.6)%,n=6]与对照组[(98.6±7.9%),n=6]相比,张力变化比较差异无统计学意义(t=0.378,P>0.05),提示天麻素不能抑制KCl预收缩作用。
3 讨论
自20世纪80年代起,血管环体外模型就被开始应用于心脑血管疾病的发病机制研究,这些模型包括胸主动脉环、腹主动脉环、颈动脉环和肺动脉环等,主要原理是通过检测各种代谢物质对血管环收缩活性如血管环的张力和各种调节因子,从而明确机制[6]。在临床新药的研究过程中,在体动物研究模型虽然能完全模拟生理状态,但其耗费资源和时间巨大[7]。分子生物学和细胞学实验虽然操作相对简单,可重复性容易,但其存在与生理状态差距过大的不足。然而,离体组织如血管环模型的研究则可以有效连接细胞学实验和整体动物实验,发挥的作用越来越重要[8]。天麻素是中药天麻中提取的有效活性成分[9],完全可以作为一种新药以离体胸主动脉环实验模型研究,为天麻素的进一步开发利用提供帮助。
本实验主要采取大鼠胸主动脉环模型进行相关研究,胸主动脉血管平滑肌细胞上主要有2种钙离子通道,即α1受体操纵性钙离子通道(Receptor-operated calcium channel,ROCC)和电压依赖性钙离子通道(Voltage dependent calcium channel,VDC),共同促使胞浆内游离钙离子升高,促使血管平滑肌收缩[10-11]。本实验首先用天麻素直接作用保留完整内皮的血管环,发现天麻素对正常的血管无舒张作用,提示天麻素在临床应用的安全性好。进一步研究发现,天麻素能显著抑制PE预收缩的所有血管环,而且有内皮组血管环收缩幅度明显高于去内皮组,提示天麻素舒张血管作用可能具有内皮依赖性。研究表明,PE能顺序激活胸主动脉血管平滑肌细胞上第二信使DAG和蛋白激酶C,激活ROCC,使钙通道开放,引起外钙内流[12-13];PE还能顺序激活第二信使ΙP3,从而激活内质网上1,4,5-三磷酸肌醇(ΙP3)受体,使肌浆网储存钙离子释放到细胞质中,即内钙释放,这两个途径都能促使血管平滑肌收缩。因此,天麻素可能通过抑制PE收缩血管的两个途径舒张血管。为进一步确认其作用的具体途径,本研究采用用无钙K-H液稳定血管环后,即细胞外液和细胞质中游离钙离子被中和,阻断了ROCC,此时,天麻素仍能抑制血管环的收缩,提示天麻素可能是通过抑制ΙP3受体调控的胞内储存钙释放使血管舒张,而且随着天麻素浓度增加,这种抑制效应增加;实验中再以3 mmol/L CaCl2恢复细胞内外游离的钙离子,天麻素组和对照组血管环收缩率无明显差异,进一步证实了天麻素不能抑制α1受体依赖性钙通道。此外,本研究对胸主动脉环平滑肌细胞上的VDC也做了相应探讨,研究表明,VDC可被高钾去极化所激活,氯化钾激活的血管收缩[14-15]。本实验用60 mmol/L KCl预收缩血管环,激活了电压依赖性钙通道,使大量钙离子内流,而天麻素并不能抑制高钾引起的血管平滑肌收缩作用,提示天麻素不能抑制VDC。
综上所述,天麻素对正常血管无舒张刺激作用;天麻素能舒张PE预收缩的血管,其机制是通过抑制血管平滑肌ΙP3受体介导的内钙释放,而非抑制α1受体依赖性钙通道或电压依赖性钙通道。此外,天麻素舒张PE收缩的血管的作用具有内皮依赖性和浓度剂量依赖效应,以往研究表明,高钾激活的血管内皮收缩的内皮依赖性与内皮中NO含量相关[16],而天麻素舒张血管的内皮依赖作用有待进一步探讨。
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Effect and mechanism of gastrodin on isolated thoracic aorta rings in rats.
ZHONG Jie-xiong,YANG Hong-hua. Department of Cardiovascular Medicine,Wuhan Commercial Staff Hospital,Wuhan 430021,Hubei,CHINA
ObjectiveTo observe the effect and mechanism of gastrodin on isolated thoracic aorta rings in rats. MethodsA perfusion model of isolated thoracic aorta ring in rats was applied to observe the direct effect of cumulative gastrodin on isolated thoracic aorta rings in rats.The same method was also used to explore the effects of the different concentration gastrodin(5 μmol/L,50 μmol/L,100 μmol/L,150 μmol/L,200 μmol/L,250 μmol/L)on endothelium-intact/denuded aorta rings pre-contracted with 10-6mol/L phenylephrine(PE).PE was used to contract the aorta rings incubated by 200 mmol/L gastrodin in the Ca2+free K-H solution,and the effect of 200 mmol/L gastrodin on aorta rings pre-contracted with 60 mmol/L KCl was observed.ResultsWith the direct effect of gastrodin on the endothelium-intact vascular ring,there was no significant difference between the gastrodin group and the control group(P>0.05)on the vascular tension.With the effect of cumulative concentration of gastrodin(≥50 μmol/L)on PE pre-contracted vascular ring were studied,the vascular ring relaxation rate in endothelium-intact gastrodin group and endothelium-denuded gastrodin group were significantly higher than control group[(41.9±8.9)%,(57.6±9.1)%,(65.0±10.2)%,(75.6±11.7)%, (81.9±12.0)%vs(10.5±1.6)%,(19.4±5.9)%,(22.6±7.2)%,(24.9±6.8)%,(25.1±7.3)%,P<0.05];Moreover,the rate of relaxation of vascular rings in the endothelium-intact gastrodin group were higher than in the endothelium-denuded gastrodin group[(20.6±2.9)%,(36.5±8.2)%,(43.7±9.3)%,(55.7±9.6)%,(58.7±9.6)%)vs(9.8±2.1)%,(15.8±4.7)%,(18.6±6.5)%,(20.3±5.0)%,(21.5±5.1)%,P<0.05].F values of multi-group were respectively 5.67,5.99,6.11,6.47, 7.05(P<0.05).When the experiment was performed on the effect gastrodin on PE pre-contracted vascular ring in the calcium free fluid K-H solution,the relaxation rate in gastrodin group[(5.1±1.2)%]was lower in the control group [(12.8±3.7)%](P<0.05);When the effect of gastrodin on 60 mmol/L KCl pre-contracted thoracic aortic rings,there was no significant difference between the gastrodin group[(96.7±8.6)%]and the control group[(98.6±7.9)%]in the vascular tension(P>0.05).ConclusionGastrodin has no effect on intact aorta ring.The relaxation mechanism of Gastrodin on aorta rings pre-contracted with PE is through the inhibition of release of Ca2+from the endoplasmic reticulum. Gastrodin can not inhibit the receptor-operated Ca2+channel and the voltage-dependent Ca2+channel.Therefore,the relaxation effect of gastrodin is endothelium-dependent and concentration-dependent.
Rat;Gastrodin;Thoracic aorta ring;Effect;Mechanism
R-332
A
1003—6350(2016)13—2073—04
10.3969/j.issn.1003-6350.2016.13.003
2015-11-12)
钟节雄。E-mail:onetoonekey@163.com